Galectin-3、MMP-9和VEGF在子宮腺肌病組織中的表達及意義*

李燦宇，劉歡歡，黨秋紅，申愛榮，封全靈

（鄭州大學第三附屬醫院 1.婦科，2.病理科，河南 鄭州 450052）

子宮腺肌病是嚴重危害婦女健康的一種疾病，發病機制尚不明確[1]，血管生成可能是子宮腺肌病發生的重要因素[2]。半乳糖凝集素3（Galectin-3）與多種疾病的發生、發展關系密切，是潛在的診斷標志物和治療靶點[3]。Galectin-3 在調節血管生成中也發揮重要作用[4]，但其在子宮腺肌病發生中的作用尚不清楚。本研究檢測Galectin-3、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在子宮腺肌病在位內膜和異位內膜組織中的表達，分析3 者在異位內膜組織中高表達的相關性，以期為探討子宮腺肌病新的治療策略提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月—2015年12月鄭州大學第三附屬醫院行手術治療并經病理證實的子宮腺肌病患者40例作為子宮腺肌病組，年齡34～54 歲，分別取其在位內膜組織和異位內膜組織用于研究，其中分泌期內膜25 例，增殖期內膜15 例。選取同期子宮肌瘤患者40例作為正常對照組，排除子宮腺肌病和子宮內膜異位癥患者，取其正常子宮內膜組織用于研究，其中分泌期內膜22 例，增殖期內膜18 例。從上述患者中分別選取20 例子宮腺肌病在位內膜和正常對照子宮內膜組織用于逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）和Western blotting 檢測，新鮮組織標本采集后液氮冷凍保存，所用組織標本經10%中性甲醛固定后石蠟包埋保存。研究經本院醫學倫理委員會同意，所有標本采集征得患者同意并簽署知情同意書。

1.2 序列與試劑

Galectin-3 引物序列參考文獻[5]，其他引物同參考文獻[6]（Galectin-3，正向引物：5'-GAATGATGTTGCCT TCCAG-3'，反向引物：5'-CACTGGTGAGGTCTATGTCA C-3'；MMP-9，正向引物：5'-TTGACAGCGACAAGAAG TGG-3'，反向引物：5'-TCAGGGCGAGGACCATAGA-3'；VEGF，正向引物：5'-CCCACCCACATACATACAT T-3'，反向引物：5'-CTCCCAACTCAAGTCCACA-3'）。Trizol 試劑、Taq Master Mix（CW0682M）、兔抗人GAPDH 多克隆抗體（CW0101M）購自北京康為世紀生物科技有限公司，逆轉錄試劑盒（K1622）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，羊抗人MMP-9 多克隆抗體（SC-6840）、鼠抗人Galectin-3 單克隆抗體（TA804697）、鼠抗人VEGF 單克隆抗體（TA803263）、兔抗人單克隆抗體MMP-9（ZA-0562）和兔抗人多克隆抗體VEGF（ZA-0509）購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.3 RT-PCR 檢測

Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度計分析純度，A260/A280 為1.8～2.0。選 擇GAPDH為內參，在MMLV RTase 作用下以隨機引物進行逆轉錄。反應體系共50 μl。反應條件為：94℃預變性90 s，94℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸1 min，重復30 個循環后72℃再延伸5 min，最后4℃終止反應。RT-PCR 擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳。以目的基因與內參的平均吸光度比值來計算目的基因mRNA 的表達水平。

1.4 Western blotting 檢測

取組織各0.2 g 于液氮中砸碎，研磨成粉末狀后轉移至離心管中，加入蛋白裂解液充分裂解細胞，置于冰上20 min，經超聲處理后于4℃、12 000 r/min 離心30 min，收集上清液并用Bradford 法定量。用10% SDS-PAGE 電泳分離，轉至PVDF 膜。5%脫脂牛奶封閉后用TBST 緩沖液洗凈，分別加入一抗4℃過夜。之后回收一抗，TBST 洗凈后加入辣根過氧化物酶（HRP）二抗，1 h 后洗膜，增強型化學發光試劑（ECL）底物顯影。以Image-Pro Plus 6.0 掃描計算吸光度值，以目標蛋白與GAPDH 蛋白的比值來表示目的蛋白的相對表達水平。

1.5 免疫組織化學法檢測

所有組織標本經石蠟包埋，3 μm 連續切片，用蘇木精-伊紅（haematoxylin endeosin,HE）染色法觀察病理變化，用Envision 免疫組織化學二步法檢測蛋白表達情況。實驗步驟參照試劑盒說明書進行操作，陽性對照切片由試劑公司提供，染色結果為陽性。陰性對照用PBS 緩沖液代替一抗，染色結果為陰性。

1.6 免疫組織化學結果判定

每張切片選10 個高倍視野（400 倍），根據染色范圍及染色強度來計算評分。按陽性細胞所占百分比評分：無陽性細胞者為0 分，1%～25%為1 分，26%～50% 為2 分，51%～75% 為3 分，76%～100%為4 分；按染色強度進行評分：其中棕褐色為3 分，棕黃色為2 分，淡黃色為1 分，無著色為0 分。將陽性細胞所占百分比與染色強度評分相乘，所得乘積為總分。若總評分≤6 分者為低表達，總評分＞6 分 者為高表達。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，進一步的兩兩比較采用χ2分割法，相關性分析采用Pearson 相關性檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義，χ2分割法兩兩比較時，P＜0.0167 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相對表達

分別檢測20 例正常對照子宮內膜組織和20 例子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相對表達（見表1 和圖1），子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的表達與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的表達均升高。

2.2 子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相對表達

分別檢測20 例正常對照子宮內膜組織和20 例子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相對表達（見圖1 和表2），子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白表達與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白表達均升高。

表1 子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相對表達 （n=20，±s）

表1 子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相對表達 （n=20，±s）

組別 Galectin-3 MMP-9 VEGF正常對照組 0.350±0.091 0.281±0.089 0.288±0.086子宮腺肌病組 0.506±0.120 0.415±0.144 0.403±0.093 t 值 4.601 3.549 4.055 P 值 0.000 0.001 0.000

2.3 子宮腺肌病在位、異位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的高表達

分別檢測40 例正常對照子宮內膜組織和40 例子宮腺肌病在位、異位內膜組織中Galetin-3、MMP-9和VEGF 蛋白表達（見圖2）。與正常對照子宮內膜組織比較，子宮腺肌病異位內膜組織中Galetin-3 和VEGF 蛋白高表達，差異有統計學意義（P＜0.05）；3組MMP-9 蛋白高表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（見表3）。

2.4 子宮腺肌病異位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白高表達的相關性

Pearson 相關性分析結果顯示，Galetin-3 和MMP-9 高表達呈正相關（r=0.493，P=0.001），Galetin-3 和VEGF 高表達呈正相關（r=0.616，P=0.000），MMP-9和VEGF 高表達呈正相關（r=0.441，P=0.004）。

圖1 Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 和蛋白的 相對表達情況

表2 子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相對表達 （n=20，±s）

表2 子宮腺肌病在位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相對表達 （n=20，±s）

組別 Galectin-3 MMP-9 VEGF正常對照組 0.376±0.121 0.347±0.112 0.359±0.113子宮腺肌病組 0.522±0.151 0.435±0.151 0.476±0.127 t 值 3.381-2.076 3.058 P 值 0.002 0.045 0.004

圖2 正常對照子宮內膜、子宮腺肌病在位和異位內膜組織中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的表達（Envision 二步法 ×100）

表3 Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白在子宮腺肌病在位、異位內膜和正常對照內膜組織中表達情況[n=40，例（%）]

3 討論

子宮腺肌病是指子宮內膜腺體和間質細胞在子宮肌層呈彌漫或局限性生長，引起月經過多、痛經、不孕不育等表現，嚴重影響患者身心健康，但仍缺乏有效的臨床治療策略[7]。子宮腺肌病的病因和發病機制尚不十分清楚，可能具有較為獨特的分子病理學特征[8]，炎癥因子、增殖-凋亡失衡、血管生成等可能參與子宮腺肌病的發生[9]，因此，了解其發病機制對尋找有效治療策略有重要意義。

Galectin-3 是半乳糖凝集素家族中唯一的嵌合型成員，在人體組織中廣泛表達，參與細胞的增殖、分化及凋亡過程，以及參與炎癥反應調節等多種生物學行為[10-11]。Galectin-3 表達與子宮內膜性疾病如子宮內膜異位癥[12]、子宮內膜癌[13]發生密切相關。有研究表明Galectin-3 在血管生成中也發揮重要作用，可調節腫瘤[4]、角膜等[14]多種組織新生血管生成。本研究結果顯示，Galectin-3 在子宮腺肌病在位內膜組織中mRNA 和蛋白表達均高于正常對照子宮內膜組織，而異位內膜組織中Galectin-3 高表達率更高，提示Galectin-3 可能參與子宮腺肌病的發生，尤其是內膜異位的發生。

VEGF 作為最強的血管生成因子，其高水平表達與子宮腺肌病發生關系密切，其高表達的致病機制尚不清楚[15]，雌激素可通過誘導VEGF 高表達及血管生成促進子宮腺肌病的發生[16]。MMP-9 是一種重要的基質金屬蛋白酶，其高表達與子宮腺肌病的發生密切相關[17]，多種信號通路可通過調節MMP-9 參與子宮腺肌病的發生[18]。MMP-9 和VEGF 還在內皮細胞抗凋亡中發揮重要作用，是子宮腺肌病發生過程中的關鍵因子[16]，下調MMP-9 的表達降低腺體細胞的侵襲能力[19]。本研究結果顯示，MMP-9 和VEGF 在子宮腺肌病在位內膜組織中mRNA 和蛋白表達均高于正常對照子宮內膜組織，兩者均在異位內膜組織中高表達且呈正相關，進一步說明兩者可能共同參與子宮腺肌病的發生、發展，可能有助于腺體細胞的異位侵襲。

研究表明，Galectin-3 在促進細胞增殖和血管生成中發揮重要作用，Galectin-3 基因敲除可通過減少VEGF 的分泌從而使腫瘤細胞血管生成障礙[20]。Galectin-3 也是MMP-9 重要的轉錄調節因子，可調節MMP-9 的表達、中斷細胞間接觸促進上皮細胞運動，如發生侵襲和轉移。本研究結果中Galectin-3 和VEGF、MMP-9 在異位內膜中的高表達均呈正相關，提示3 者可能在子宮腺肌癥發生、發展尤其是異位侵襲中共同發揮作用，其具體分子調節機制還需要進一步深入研究。

綜上所述，Galectin-3、VEGF 和MMP-9 在子宮腺肌病內膜組織中表達升高，3 者在異位內膜組織中均呈高表達且呈正相關，提示3 者高表達可能共同參與子宮腺肌病的發生和異位侵襲，為繼續探討子宮腺肌病的發生機制和新的治療策略提供參考。