HPV感染對宮頸COX-2表達及血PGE2表達水平的影響*

黃晶，潘宜云，周小娟，余英，程細云，劉聯斌，申昌梅，羅德平

（贛州市腫瘤醫院 1.婦科，2.化療科，3.檢驗科，江西 贛州 341000）

人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染可導致慢性炎癥，炎癥相關基因環氧合酶-2（cyclooxygenase,COX-2）及前列腺素E2（Prostaglandin E2,PGE2）在慢性炎癥啟動致癌信號通路過程中均具有重要作用，且可以相互作用，共同促進腫瘤的增殖、凋亡及轉移過程[1-3]。本研究初步探討HPV 感染對慢性宮頸炎組織、子宮頸上皮瘤（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）和宮頸癌組織中的COX-2 表達水平及血PGE2含量的影響；研究從宮頸炎癥病變至宮頸癌轉化的不同階段，HPV 感染的狀態及程度與COX-2 和PGE2表達的相關性，揭示HPV 感染與炎癥反應在宮頸病變進展及評估宮頸早期病變的重要性。可望為進一步闡明宮頸癌發生、發展的分子生物學機制，為相關疾病的臨床診斷、治療、預后提供理論與實驗依據，為宮頸癌的三級預防提供新的視角。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年1月—2015年12月贛州市腫瘤醫院符合納入標準的初診為宮頸癌患者40 例作為宮頸癌組。年齡28～69 歲，中位年齡45 歲；腺癌5 例 （12.5%），鱗癌35 例（87.5%）。按照國際婦產聯盟 （Figo）宮頸癌分期，Ⅰ期16 例（40.0%），Ⅱ期10 例（25.0%），Ⅲ期14 例（35%），取標本前均未接受放、化療。選取同期因婦科疾病治療或門診治療的慢性宮頸炎患者20 例（宮頸炎組）及CIN 患者20 例（CIN 組）。

宮頸癌患者納入標準：①初診宮頸癌病理診斷明確患者；②Karhofsky 評分＞70 分；③2 周內未服用消炎痛、阿司匹林等影響前列腺素代謝類藥，3 d 內未做陰道沖洗或使用陰道內藥物，24 h 內無性生活；④最小年齡18 歲，最大年齡70 歲；⑤患者自愿并簽署同意書。

慢性宮頸炎、CIN 患者納入標準：①慢性宮頸炎、CIN 診斷明確；②2 周內未服用消炎痛、阿司匹林等影響前列腺素代謝類藥，3 d 內未做陰道沖洗或使用陰道內藥物，24 h 內未進行性生活；③最小年齡18 歲，最大年齡70 歲；④患者自愿并簽署同意書。排除標準：①合并其他惡性腫瘤患者；②盆腔有放療史；③合并有其他嚴重心、肺、肝、腎疾病史患者；④近期服用COX 抑制劑如：阿司匹林、消炎痛等。研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 HPV 病毒檢測標本的采集HC Ⅱ配套采樣器采集保存宮頸細胞標本1 份，受檢者取膀胱截石位，窺陰器暴露宮頸后，采用專用宮頸細胞采集刷按順/逆時針旋轉3～5 圈，收集細胞后固定，標本上標注姓名、年齡及病案號相關信息。按照美國Digene 公司HC Ⅱ HPV DNA 檢測試劑盒說明書步驟，通過雜交捕獲Ⅱ代技術檢測HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和68 型），DML 2000 微孔板判讀器測量樣本的相對光單位（relative light unit,RLU），宮頸癌組的RLU/標準陽性對照的RLU 比值≥ 1.0 診斷為HPV 陽性，若比值＜1.0，則判定為陰性。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測COX-2 mRNA術中取新鮮手術切除宮頸病變標本，立即放入液氮中保存備用。Trizol 提取組織總RNA，根據Promega（北京）生物技術有限公司M-MLV 操作說明書逆轉錄合成cDNA。qRT-PCR 檢測組織COX-2 及內參基因GAPDH的表達。引物序列：COX-2 正向引物為5'-CTCCTGTGCCTGATGATTGC-3'，反向引物為5'-CAGCCCGTTGGTGAAAGC-3'；GAPDH 正 向 引 物為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，反向引物為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。采用20.0 μl 反應體系：SYBR Taq 10.0 μl，正反向引物（2.5 μmol/L） 各0.5 μl，cDNA 1.0 μl，RNase-Free H2O 8.0 μl，反向 引物（2.5 μmol/L）0.5 μl。逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）參數：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，總計45 個循環。

1.2.3 ELISA 檢測血PGE2含量分別采集CIN 組及宮頸癌組患者空腹靜脈血5 ml，5% EDTA 防凝，采血后2 000 r/min 離心5 min，分離血漿，置入-20℃冰箱中冷凍保存待測。ELISA 檢測血清PGE2的水平，PGE2檢測試劑盒購自美國R&D 公司。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗或秩和檢驗，相關分析采用Spearman 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV 病毒載量及COX-2 在不同宮頸組織中的表達

隨著宮頸病變進展，HPV 病毒載量也增多，其中宮頸炎組（3.6±0.6）、CIN 組（6.5±1.5）、宮頸癌組（10.4±2.9），CIN 組及宮頸癌組與宮頸炎組比較，差異有統計學意義（F=66.950，P=0.000）（見圖1A）；qRT-PCR 檢測結果可見不同宮頸組織中COX-2 mRNA 均有一定程度表達，與宮頸炎組（4.1±0.9）比較，CIN 組（7.6±1.3）中COX-2 表達升高，差異有統計學意義（t=9.884，P=0.001）；宮頸癌組（10.5±1.1）中COX-2 mRNA 表達與CIN 組比較，差異有統計學意義（t=-9.052，P=0.000），宮頸癌組中COX-2 mRNA 表達升高。由此可知，COX-2 表達與宮頸癌進展有關（見圖1B）。

2.2 宮頸組織中HPV 感染與COX-2、PGE2 mRNA 表達的相關性

根據HPV 感染狀態而分的HPV 陰性組和HPV陽性組的COX-2 mRNA 表達水平分別為（4.7±1.2）和（10.2±1.6），HPV 感染陽性宮頸組織中COX-2 mRNA 表達水平高于陰性宮頸組織（t=15.062，P=0.000）（見圖2A）；血清PGE2mRNA 表達水平分別為（7.0±1.9）和（10.5±2.3），HPV 感染陽性宮頸組織中PGE2mRNA 表達與陰性宮頸組織比較，差異有統計學意義（t=6.426，P=0.000）陽性宮頸組織中PGF2mRNA 表達升高（見圖2B）。

2.3 宮頸癌患者血清PGE2 與HPV 病毒載量的相關性

宮頸癌患者HPV 感染陽性與血清PGE2含量相關，進一步分析得出患者HPV 感染后，隨HPV 病毒載量升高，血清PGE2含量亦隨之升高，宮頸癌患者血清PGE2與HPV DNA 載量呈正相關（rs=0.257，P=0.003）。見圖3。

圖1 HPV 病毒載量與COX-2 在不同宮頸組織中的表達 （±s）

圖2 宮頸組織HPV 感染與COX-2、PGE2 mRNA 表達的相關性 （±s）

2.4 宮頸癌組織COX-2 mRNA 與血清PGE2 mRNA 表達的相關性

高表達COX-2 mRNA 與血清PGE2mRNA 表達增加相關，本研究結果進一步提示宮頸組織癌中COX-2 mRNA 表達 與血清PGE2mRNA 表達相關，COX-2、PEG2mRNA 表達經正態性檢驗（P＜0.05）不服從正態分布，采用Spearman 相關性檢驗分析COX-2、PEG2mRNA 表達之間的相關性，結果顯示兩者呈正相關（rs=0.684，P=0.000）。見圖4。

圖3 血清PGE2 與HPV 病毒載量的相關性

圖4 宮頸癌組織COX-2 mRNA 表達與血清PGE2 mRNA表達的相關性

3 討論

宮頸癌是女性第二大常見惡性腫瘤，全球每年的新發例數約為53 萬，占所有女性腫瘤的12 %，死亡數達27.5 萬例[4]。我國是宮頸癌的高發區，占全世界新發例數的1/5～1/4，每年2 萬～3 萬婦女死于宮頸癌，嚴重威脅女性健康[5]。2004年IRAC 指出，HPV感染是CIN 及宮頸癌發生的必要因素，尤其是HPV 16 的持續感染。早期宮頸癌的治愈率在90%以上，早發現早治療是提高宮頸癌治愈率的關鍵。HC Ⅱ是目前宮頸癌篩查最常見方法之一，應用于HPV 感染的篩查，具有高度敏感性、客觀性及可重復性。許多研究指出CIN 的病變程度與HPV 病毒載量相關，HPV病毒載量越高，宮頸癌發生的風險越高[6-7]，但也有研究指出HPV 病毒載量與宮頸病變無相關[8]，該結論仍存在一定爭議。本研究通過HC Ⅱ檢測HPV 分型及病毒載量，以HPV 16 感染為主，統計分析宮頸癌HPV 病毒載量最高，CIN 次之，宮頸炎最低。

COX 是前列腺素生物合成過程中的關鍵限速酶，可催化花生四烯酸轉化成各類前列腺素[9]。前列腺素合成后，以自分泌或旁分泌方式釋放并結合細胞特異性G 蛋白偶聯受體，從而參與調控細胞內的生理活動[10]。COX-2 作為宮頸癌預后的危險因素，與臨床分期、淋巴結轉移、腫瘤生長浸潤及淋巴結轉移均密切相關，甚至貫穿宮頸癌病變的整個過程[11-13]。本研究結果顯示，COX-2 在宮頸癌及CIN 組織中表達均高于宮頸炎組織，這與早期病變時主要以炎癥反應為主這一因素相關。HPV 病毒E6、E7基因可誘導COX-2 異常高表達，這與其E6、E7 蛋白結合性抑制p53 及pRb 蛋白，進而導致DNA 損傷修復受損；E6 蛋白轉錄激活C-myc基因并與誘導COX-2 表達相關[14-15]。本研究中，HPV感染后可提高COX-2基因的表達。

PGE2是花生四烯酸在COX 作用下的產物之一，其過表達可促進腫瘤細胞增殖、遷移、腫瘤血管生成，抑制腫瘤細胞凋亡，以及弱化宿主免疫功能，鄒余糧等[16]研究發現血清及組織PGE2含量與宮頸病變程度呈正相關，這與COX-2 蛋白生成增加或活性增強促進PGE2表達有關。SALES 等[17]證實，COX-2 與PGE2受體在宮頸癌組織中表達同時上調。本研究發現COX-2表達與PGE2呈正相關。此外，HPV 感染陽性宮頸病變組織血清PGE2含量高于HPV 感染陰性，進一步分析發現PGE2含量與HPV-DNA 載量呈正相關，HPV 感染如何促進PGE2表達還有待進一步研究。DEVA 等[18]在白色念珠菌中插入含HPV16 病毒序列，感染陰道上皮系統后促進PGE2合成酶表達，從而提高PGE2表達。研究指出HPV16 E5 蛋白可通過COX-2 依賴途徑促進宮頸癌細胞PGE2受體EP4 表達[19]。

目前HPV 檢測已列入宮頸癌常規篩查中，但HPV 定量檢測存在爭議。EINSTEIN 等研究[20]指出在確診宮頸癌前，HPV 感染且高病毒載量，進展為宮頸癌概率較低病毒載量者高30～60 倍。多種高危型HPV 病毒載量與宮頸癌前病變有關，研究表明[21]HPV16 病毒載量對宮頸癌病變預測最為重要，HPV 16感染者高病毒載量與CIN2+（CIN2 及以上病變）病變級別存在相關（）。HPV定量檢測對宮頸癌具有重要預測意義。本研究認為，在已確定HPV 感染患者中進行HPV 定量檢測具有必要性，同時COX-2 與PGE2等炎癥相關分子水平檢測亦有重要臨床指示作用。