乳頭狀甲狀腺癌中microRNA-599、BRD4表達及與臨床病理特征和預后的關系

賴明華，楊嵐淞

（云南省第一人民醫院 1.乳腺甲狀腺外科，2.消毒供應中心，云南 昆明 650032）

乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是甲狀腺癌最常見的分化類型，約占甲狀腺癌發生的85%，具有腫瘤生長緩慢、惡化程度低、潛伏時間長等特點[1]。近年來，PTC 發病率呈上升趨勢，雖然在其治療方面取得了進展，但其存活率仍存在進一步改善的可能。明確高危病變臨床有用預測因子是診斷和治療惰性和侵襲性疾病的關鍵[2]。MicroRNA（miRNA）是具有調節功能和顯著組織特異性的小RNA 分子，能夠調節若干通路的多個靶標，常在癌癥中異常表達，已成為一類癌癥診斷、治療及預后判斷的新型生物標志物[3]。大量研究表明，多個miRNAs 如miR-34a、miR-146b、miR-31、miR-221、miR-21 等 在PTC 中過量表達，與PTC 發生及預后有關[4]。但miR-599 在PTC 中表達水平及與PTC 關系鮮有報道。溴結構域蛋 白4（bromodomain-containing protein 4,BRD4）是BET 家族主要成員之一，在多種疾病的發生、發展中發揮重要作用。研究報道，抑制BRD4 表達可以影響腫瘤細胞生物活性，減緩腫瘤生長[5]。因此，本研究旨在分析miR-599 和BRD4 在PTC 癌變組織中的相對表達量及其與PTC 發生、發展及預后的關系，以期為診斷和治療PTC，改善患者預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2005年5月—2007年3月云南省第一人民醫院接受甲狀腺手術的PTC 患者52 例作為研究對象。其中，男性14 例，女38 例；年齡27～45 歲，平均（35.13±7.02）歲；癌旁正常甲狀腺組織41 例。根據美國癌癥聯合委員會癌癥分期手冊中分化型甲狀腺癌TNM 分期標準[6]：Ⅰ期24 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期8 例，Ⅳ期5 例。每例患者切除甲狀腺后，立即留取腫瘤組織和癌旁正常甲狀腺組織（距腫瘤1 cm 處正常甲狀腺組織），置于液氮中冷凍保存。納入標準：①所有患者符合甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌診療指南中PTC 診斷標準[7]；②病灶＞5 mm；③均行全甲狀腺切除手術；④經本院醫學倫理委員會批準，所有患者及其家屬知情并自愿簽署同意書。排除標準：①其他分化型甲狀腺癌，如濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌；②有其他臟器腫瘤；③術前因其他腫瘤進行過放化療治療；④有既往頸部手術史。

1.2 試劑與序列

RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司，BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，BRD4 抗體和GAPDH 抗體購自美國Cell Signaling 公司，ECL 超敏發光液和Western blotting 一抗稀釋液購自江蘇碧云天生物技術研究所，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-599 正向引物：5'-GUU GUGUCAGUUUAUCAAAC-3'，反向引物：5'-CTCCTAT CGCACTTTAATCTCTAACT-3'；內參U6 snRNA 正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；BRD4正向引物：5'-GTGGGAGGAAAGAAACAGGGACA-3'，反向引物：5'-AGGAGGAGGATTCGGCTGAGG-3'；內參GAPDH 正向引物：5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCA G-3'，反向引物：5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTG-3'。

1.3 方法

1.3.1 RNA 和蛋白提取取液氮中保存的甲狀腺腫瘤組織和正常組織，研磨，組織總RNA 和總蛋白的提取采用試劑盒法，純化后采用分光光度儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）檢測總RNA 濃度和純度，提取RNA 溶液A260/A280 值＞1.8 可用于后續檢測，同時采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測提取純化后蛋白濃度。

1.3.2 RT-PCR提取總RNA 溶液經稀釋后，用于逆轉錄生成cDNA，以cDNA 為模板進行RT-PCR 檢測miR-599 相對表達量，以U6 snRNA 為內參對照，RT-PCR 擴增總體系20 μl，Mix 10 μl，正反向引物各1 μl，模板2 μl，DEPC 水6 μl。RT-PCR 程序：95℃預變性15 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min 循環擴增，共40 個循環。每個樣本重復3 次。

1.3.3 Western blotting取蛋白樣品，經電泳、轉膜、封閉、洗膜后，分別加入BRD 抗體和GAPDH 抗體稀釋溶液中，4℃、低速震蕩條件下，孵育過夜。取出后用15 ml TBST 沖洗3 次，10 min/次。沖洗后，將膜放于辣根過氧化酶標記的牛抗鼠第二抗體IgG 孵育液中，震蕩孵育1 h，取出后用15 ml TBST 沖洗3 次，10 min/次。最后，將膜放入ECL 顯影液中，充分接觸3～5 min，UVP 凝膠成像儀中曝光、拍照。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，繪制Kaplan-Meier 生存曲線，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-599、BRD4 在PTC 組織中的表達

癌變組織中miR-599 相對表達量與正常組織中miR-599相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），癌變組織低于正常組織（見表1）；癌變組織中BRD4相對表達量與正常組織中BRD4 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），癌變組織高于正常組織（見表1 和圖1）。

2.2 miR-599、BRD4 相對表達量與PTC 臨床病理特征的關系

TNM 分期晚的患者miR-599 相對表達量低于分期早的患者（P＜0.05），TNM 分期晚的患者BRD4 相對表達量高于分期早的患者（P＜0.05）；腫瘤直徑＞1 cm 患者miR-599 相對表達量低于腫瘤直徑≤1 cm 患者（P＜0.05），腫瘤直徑＞1 cm 患者BRD4 相對表達量高于腫瘤直徑≤1 cm 患者（P＜0.05）；腫瘤侵犯包膜患者miR-599 相對表達量低于腫瘤未侵犯包膜患者（P＜0.05），腫瘤侵犯包膜患者BRD4 相對表達量高于腫瘤未侵犯包膜患者（P＜0.05）；淋巴結轉移患者miR-599 相對表達量低于無淋巴結轉移患者（P＜0.05），淋巴結轉移患者BRD4 相對表達量高于無淋巴結轉移患者（P＜0.05）。見表2。

表1 miR-599、BRD4 在癌變組織和正常組織中的相對表達量比較 （±s）

表1 miR-599、BRD4 在癌變組織和正常組織中的相對表達量比較 （±s）

組別 nmiR-599 BRD4癌變組織 52 0.88±0.10 4.57±1.27正常組織 41 3.12±0.84 1.25±0.31 t 值 19.086 18.200 P 值 0.000 0.000

圖1 BRD4 蛋白相對表達量

2.3 miR-599、BRD4 相對表達量與預后關系

miR-599 和BRD4 相對表達量以癌變組織中平均表達量值為界，分為高水平和低水平。高水平患者miR-599 和BRD4 與低水平患者比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。高水平miR-599 患者5 和10年病死率均低于低水平患者；高水平BRD4 患者5 和10年病死率均高于低水平者。見表3 和圖2。

2.4 miR-599、BRD4 相對表達量相關性分析

PTC 癌變組織中miR-599 與BRD4 相對表達量呈負相關（r=-0.872，P=0.000）。見圖3。

表2 PTC 臨床病理參數與miR-599、BRD4 相對表達量的關系

表3 miR-599、BRD4 相對表達量與預后關系 例（%）

圖2 miR-599、BRD4 相對表達量高水平組和低水平組生存曲線

圖3 miR-599、BRD4 相對表達量相關性分析

3 討論

PTC 是甲狀腺組織中最常見的惡性腫瘤，受激素、遺傳、環境等因素影響，在基因方面，PTC 的特征是通過激活BRAF 和RET/PTC 基因重組中的基因突變而改變RET/PTC-RAS-BRAF 信號傳導途徑[8]。正常細胞中基因表達受到復雜基因調控網絡的高度調控，其調控網絡被阻斷或異常過量表達則可能引發各種疾病，包括癌癥[9]。miRNA 是一類長度約為20～24 個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，參與基因轉錄后表達調控，一個miRNA 可以同時調控多個靶基因，多個miRNA 也可以調控同一個基因[10]。miRNAs 通過干擾蛋白表達，調控細胞增殖、分化和凋亡，通常導致轉錄抑制或靶基因降解和基因沉默，越來越多的研究表明，miRNAs 異常表達與癌癥發生相關，表現出在正常組織和腫瘤組織中表達量不同[11]。戴璇璇等[12]采用基因芯片技術和RNA 印記雜交法檢測PTC 甲狀腺組織中miRNA 表達水平，結果顯示miR-34a、miR-146b、miR-31、miR-221、miR-21 在PTC 甲狀腺腫瘤組織中過表達，并提示miR-221 和miR-146 在PTC 預后預測中具有重要作用。SUN 等[13]研究報道，miR-146a 和miR-146b 在甲狀腺組織中過量表達與PTC 發生及惡化有關，可能是PTC 潛在的生物標志。PERDAS 等[14]研究發現，let-7 miRNA 能夠抑制腫瘤RAS 基因表達，起到抑制腫瘤作用，可作為PTC 的新型診斷、治療、監測及預后標志物。李桂榮等[15]研究報道，miR-221 和miR-222 在PTC 癌變組織中過表達，與PTC 腫瘤侵犯包膜、局部淋巴結轉移等相關，miR-221 和miR-222 對PTC 臨床診斷、治療及預后有指導意義。

目前，miR-599 已被發現在肝細胞癌和乳腺癌中表達下調。TIAN 等[16]研究報道，hsa-miR-599 在肝細胞癌中表達下降，而hsa-miR-599 過表達可通過抑制靶基因MYC 抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，提示hsa-miR-599 可以作為肝細胞癌診斷和治療的生物標志物。但miR-599 在PTC 中表達尚未見報道。本研究采用RT-PCR 檢測PTC 甲狀腺癌變組織和癌旁正常組織中miR-599 的相對表達量，miR-599 在PTC癌變組織中相對表達量低于正常組織。miR-599 相對表達量與患者病理特征關系分析結果表明，miR-599相對表達量在PTC 患者TNM 分期、腫瘤直徑、腫瘤有無侵犯包膜、淋巴結是否轉移方面存在差異，與在肝細胞癌和乳腺癌中表達趨勢相同，說明miR-599 相對表達量與PTC 發生、發展相關。miR-599 相對表達量高水平患者5 和10年病死率均顯著低于miR-599 相對表達量低水平患者，說明miR-599 相對表達量影響患者預后。

BRD4 是BET 家族成員，可以通過結合乙酰化組蛋白而影響下游基因轉錄，加快腫瘤細胞生長，許多研究已證實，BRD4 抑制劑可以導致癌細胞周期停滯或凋亡，是癌癥治療的新靶點[17-18]。有研究報道，BRD4 在膀胱癌病變組織中過量表達，通過上調C-myc 正向調節EZH2，促進癌細胞增殖，而抑制BRD4 能夠減少癌細胞增殖，同時促進癌細胞凋亡，提示BRD4 是一種干擾轉錄程序治療癌癥的新型藥理治療靶點。在小細胞肺癌中BRD4 有同樣的表達趨勢[19]。在甲狀腺癌中，GAO 等[20]研究報道，BRD4 在甲狀腺癌組織和細胞系中上調，而抑制BRD4 表達可導致癌細胞周期停滯，增強患者碘攝取進而抑制腫瘤生長。本研究結果，BRD4 在PTC 癌變組織中相對表達量高于正常組織，BRD4 相對表達量在PTC 患者TNM 分期、腫瘤直徑、腫瘤有無侵犯包膜、淋巴結是否轉移有差異，且BRD4相對表達量高水平患者5 和10年病死率高于BRD4 相對表達量低水平患者，與GAO 等研究趨勢一樣，說明BRD4 與PTC 發生、發展及預后密切相關。WANG 等[21]研究報道，hsa-miR-599 在乳腺癌中通過下調BRD4 抑制乳腺癌細胞增殖、生長。本研究對PTC 癌變組織中miR-599 和BRD4 相對表達量的相關性分析結果，PTC癌變組織中miR-599 和BRD4 相對表達量呈負相關，說明miR-599 和BRD4 在PTC 中也可能存在相互作用關系。

綜上所述，miR-599 在PTC 癌變組織中下調，BRD4 在PTC 癌變組織中上調，可能參與PTC 患者癌細胞增殖、分化、轉移，影響患者預后，可作為臨床診斷、治療PTC，預測患者預后的靶基因。本研究初步分析miR-599 和BRD4 在PTC 癌變組織中的相對表達趨勢，而對其作用機制尚不完全清楚，因此需進一步研究miR-599 和BRD4 影響PTC 患者臨床病理特征及對PTC 癌細胞生物活性的作用機制。