ANGPTL 3和ECE-1在食管癌患者中的表達及臨床意義

劉仲陽，袁欣

（保定市第二中心醫院 胸外科，河北 保定 072750）

食管癌（esophageal carcinoma,EC）是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，據統計，2012年全球EC 的新發病例約45.6 萬，死亡病例約40.0 萬[1]。我國EC的發病率居世界首位，每年約有25.9 萬新發病例，21.1 萬死亡病例[2]。近年來，EC 的診斷和治療取得了較大進展，然而EC 患者的預后仍不樂觀，其5年生存率僅25%左右[3]。侵襲和轉移是導致EC 患者不良預后的主要原因[4]，而新生血管形成在EC 侵襲轉移過程中發揮重要作用。血管生成素樣蛋白（angiopoietinlike protein,ANGPTL）是一類分泌型糖蛋白，其結構類似于血管生成素，而功能與血管內皮生長因子相似，ANGPTL 3 可誘導新生血管形成[5]，進而促進腫瘤生長和侵襲。目前關于ANGPTL 3 的研究尚處于初始階段，且ANGPTL 3 在EC 發生、發展過程中的作用所知甚少。內皮素（Endothelin,ET）系統高度活化與腫瘤新生血管形成密切相關[6]，內皮素轉化酶（endothelinconverting enzyme,ECE）可裂解前體ET，進而激活ET 系統。有研究證實，內皮素轉化酶-1（endothelinconverting enzyme-1,ECE-1）可誘導前列腺癌細胞發生侵襲[7]。本研究旨在檢測ANGPTL 3、ECE-1 在EC組織中的表達情況，分析其表達對EC 患者病情預測及預后判斷的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2011年1月—2013年1月保定市第二中心醫院行切除手術的EC 患者的癌組織及其癌旁正常組織的石蠟標本。納入標準：①具備完整的病歷資料；②術前未接受放化療；③術后經病理診斷證實為EC；④均簽署知情同意書。排除標準：①嚴重肝腎功能不全；②合并全身性感染；③合并其他惡性腫瘤等。共選取95 例EC 患者。其中，男性49 例，女性46 例；年齡＜60 歲患者65 例，≥60 歲患者30 例；中高分化程度 72 例，低分化程度23 例；腫瘤直徑＜5 cm 58 例，腫瘤直徑≥5 cm 37 例；有淋巴結轉移52 例，無淋巴結轉移43 例；有遠處轉移34 例，無遠處轉移61 例；TNM分期，Ⅰ、Ⅱ期75 例，Ⅲ、Ⅳ期20 例。研究經本院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 免疫組織化學法檢測ANGPTL 3、ECE-1 的表達

取EC 組織和癌旁正常組織的石蠟標本，常規二甲苯脫蠟、浸泡水化（依次為100%、95%、80%和70%酒精）后，蒸餾水清洗3 次，每次3 min；滴加3% H2O2，孵育10 min，滅活內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，每次3 min；枸櫞酸鈉溶液（10 mmol/L，pH 6.0），加熱至100℃，持續10 min，逐漸冷卻至室溫，進行抗原修復，PBS 洗滌3 次，每次3 min；滴加羊血清工作液，37℃封閉10 min，棄去血清；分別滴加ANGPTL 3、ECE-1 一抗工作液，4℃孵育過夜，PBS 洗滌3 次，每次3 min；滴加生物素二抗，室溫孵育30 min，PBS 洗滌3 次，每次3 min；滴加新鮮配制的DAB 溶液，進行顯色反應，蒸餾水清洗3 次，每次3 min；蘇木精-伊紅染色法復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。結果判定：ANGPTL 3、ECE-1 主要定位于細胞質。光學顯微鏡下，隨機選取10 個高倍視野，每個視野計數100 個腫瘤細胞。陽性細胞百分比：＜5%為0 分；6%～25%為1 分；26 %～50% 為2 分；51%～75% 為3 分；＞75%為4 分。著色強度：黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕褐色為3 分。根據陽性細胞百分比評分與著色強度評分的乘積進行結果判定，5～12 分為陽性表達，0～4 分為陰性表達。

1.3 術后隨訪

以患者術后為起點，通過電話、門診等方式對患者及其家屬進行隨訪，隨訪時間為手術后1～60 個月，直至患者死亡或者隨訪時間結束。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計數資料以例或率（%）表示，兩樣本間陽性率的比較分別采用χ2檢驗，兩蛋白表達水平間的相關性采用Pearson 相關分析，EC 患者預后的影響分析采用Kaplan Meier 法、Log-rank χ2檢驗及Cox 比例風險回歸模型，對各組生存率曲線分布進行分析，P＜0.05 為差異有統計學 意義。

2 結果

2.1 ANGPTL 3、ECE-1 在不同食管組織中的表達情況

EC組織中ANGPTL 3的陽性表達率與癌旁正常組織比較，差異有統計學意義（χ2=73.889，P=0.000），EC 組織[63.16%（60/95）]高于癌旁正常組織[4.21%（4/95）]；EC 組織中ECE-1 的陽性表達率與癌旁正常組織比較，差異有統計學意義（χ2=66.193，P=0.000）；EC 組織[53.68%（51/95）]高于癌旁正常組織[1.05%（1/95）]。見圖1、2。

2.2 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達與患者臨床病例特征的關系

EC 組織中，ANGPTL 3 表達與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM 分期均無關（P＞0.05），而與腫瘤直徑相關（P＜0.05）。ANGPTL 3 在腫瘤直徑≥5cm 的EC 組織中的陽性表達率為78.38%（29/37），高于在腫瘤直徑＜5 cm 的EC組織中的陽性表達率[53.45%（31/58）]（P＜0.05）；ECE-1 表達與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、淋巴結轉移及TNM 分期均無關（P＞0.05），而與遠處轉移相關（P＜0.05）。ECE-1 在有遠處轉移的EC 組織中的陽性表達率為76.47%（26/34），高于無遠處轉移的EC 癌組織中的陽性表達率[40.98%（25/61）]（P＜0.05）。見表1。

2.3 EC 組織中ANGPTL 3 與ECE-1 表達的相關性

Pearson 相關分析結果顯示，在EC 組織中，ANGPTL 3與ECE-1表達呈正相關（r=0.610，P=0.000）（見表2）。相關散點數據見圖3。

2.4 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達對患者預后的影響

根據EC 組織中ANGPTL 3表達情況，將EC患者分為ANGPTL 3陽性表達組和ANGPTL 3 陰性表達組，ANGPTL 3 陽性表達組術后5年總生存率與ANGPTL 3 陰性表達組比較，差異有統計學意義（χ2=29.760，P=0.000），ANGPTL 3 陽性表達組[25.00%（15/60）]低于ANGPTL 3陰性表達組[82.86%（29/35）]。Log-rank χ2檢驗結果顯示，ANGPTL 3 陽性表達組的平均生存時間與ANGPTL 3陰性表達組比較，差異有統計學意義（χ2=26.979，P=0.000），ANGPTL 3 陽性表達組[（40.35±2.43）個月]低于ANGPTL 3 陰性表達組[（56.17±1.59）個月]（見圖4A）。

圖1 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 的表達情況 （蘇木精-伊紅 ×200）

根據EC 癌組織中ECE-1 表達情況，將EC 患者分為ECE-1 陽性表達組和ECE-1 陰性表達組，ECE-1 陽性表達組的術后5年總生存率與ECE-1 陰性表達組比較，差異有統計學意義（χ2=7.464，P=0.006），ECE-1 陽性表達組[33.33%（17/51）]低于 ECE-1 陰性表達組[61.36%（27/44）]。Log-rank χ2檢驗結果顯示，ECE-1 陽性表達組的平均生存時間與ECE-1 陰性表達組比較，差異有統計學意義（χ2=9.788，P=0.002），ECE-1 陽性表達組[（40.43±2.67）個月]低于ECE-1 陰性表達組[（52.84±2.00）個月]（見圖4B）。

表1 患者臨床病例特征與EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達的關系 例

表2 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達的相關性 例

圖3 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達相關性散點圖

2.5 EC 生存預后的影響因素分析

以本研究95 例患者資料為樣本，以EC 生存預后狀態為應變量（賦值：1=死亡，0=生存，t=生存期），建立Cox 比例風險模型。自變量為EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達。此外，加上單因素分析中 α入=0.10 的指標，如腫瘤分化程度、遠處轉移、腫瘤直徑及TNM 分期等指標/因素，回歸過程采用后退法，自變量退出α出=0.05。回歸結果：遠處轉移及ANGPTL3、ECE-1 表達均被保留入回歸模型（P＜0.05），相對危險度為1.6～2.3，提示遠處轉移，ANGPTL 3、ECE-1 表達陽性是影響EC 生存預后的危險因素。見表3。

圖4 EC 組織中ANGPTL 3、ECE-1 表達對患者預后的影響

表3 EC 生存預后的影響因素Cox 分析結果

3 討論

目前發現的ANGPTL 家族蛋白共有8 種，分別命名為ANGPTL 1～8，且不同ANGPTL 蛋白在功能上表現出多樣性，如ANGPTL 1 在炎癥、脂肪代謝中發揮作用，而ANGPTL 3 參與調節胰島素抵抗、脂肪代謝等[8]。ANGPTL 3 基因定位于染色體1p31，編碼由460 個氨基酸組成的分子量約為70 kD 的分泌型蛋白，ANGPTL 3 在肝臟組織中特異性表達，而在其他組織中的表達量極少[9-10]。目前，關于ANGPTL 3與腫瘤的關系的研究較少，KOYAMA 等[11]在口腔癌中的研究發現，ANGPTL 3 呈高表達狀態，且與腫瘤大小呈正相關。而本研究中，與癌旁正常組織比較，ANGPTL 3 在EC 癌組織中的表達增加，且腫瘤直徑越大，ANGPTL 3 陽性率越高，提示ANGPTL 3 可能參與了EC 腫瘤形成。同時ANGPTL 3 高表達可促進腫瘤生長，新生血管形成是實體腫瘤生長必備條件，推測ANGPTL 3 可能通過誘導新生血管形成，進而促進腫瘤生長。CAMENISCH 等[5]證實ANGPTL 3 與整合素αvβ3 受體結合，可刺激血管生成，進而誘導內皮細胞的黏附和遷移。近年來，關于ANGPTL 3 促進新生血管形成的機制研究并未取得突破性進展，本研究將在后續工作中對其內在機制進行深入探究。

ET-1 是一種內源性生物多肽，具有強大的收縮血管作用，在調節微循環灌流及血管張力方面發揮非常重要的作用，ECE-1 可裂解前體ET-1，生成成熟的ET-1，進而參與機體的生理病理過程[12-13]。大量研究證實，ECE-1 在子宮內膜癌[14]、前列腺癌[15]、肺癌等[16]多種腫瘤細胞中表達增加，而關于ECE-1 在腫瘤細胞中所發揮的功能及其高表達的臨床意義的報道較少，如SMOLLICH 等[17]發現，在乳腺癌患者中，ECE-1 高表達與高復發率密切相關。本研究結果顯示，ECE-1在EC 組織中具有較高的陽性表達率，且ECE-1 高表達與腫瘤發生遠處轉移相關，提示ECE-1 在EC 發生和惡性進展（遠處轉移）中發揮促進作用。體外細胞水平的研究結果表明，ECE-1 能夠促進口腔鱗癌細胞增殖[18]、增強前列腺癌細胞[19]和卵巢癌細胞[20]的侵襲能力，以上研究結論與本研究的臨床病例研究結果，共同證實ECE-1 參與并促進腫瘤發生侵襲轉移，本研究推測ECE-1 可能通過激活ET 系統，參與調節腫瘤新生血管形成過程，進而為腫瘤發生侵襲轉移提供條件，其內在機制將在后續工作中進行深入探索。

以上結果提示，ANGPTL 3 和ECE-1 可能在新生血管形成過程中均發揮促進作用，本研究進一步地分析ANGPTL 3 與ECE-1 表達之間的相關性，Pearson相關分析結果顯示，在EC 癌組織中ANGPTL 3 與ECE-1 表達之間呈正 相 關，提示ANGPTL 3 與ECE-1 在EC 腫瘤形成、腫瘤生長及惡性進展過程中可能發揮協同作用，共同誘導腫瘤新生血管形成。而Kaplan Meier 法的分析結果顯示，ANGPTL 3 陽性表達及ECE-1 陽性表達，均可能預示著患者較低的術后總生存率和較短的平均生存時間，提示ANGPTL 3 和ECE-1 高表達與EC 患者不良預后密切相關。此外，Cox 回歸分析也證實：ANGPTL 3 陽性表達及ECE-1陽性表達，均是EC 患者生存預后的危險因素。當然，由于本研究中的樣本數量有限，為得到更確切的結論，后期將繼續擴大樣本量進行統計分析。

綜上所述，本研究發現在EC 組織中，ANGPTL 3和ECE-1 均具有較高的陽性表達率，均與患者較差的病理特征、不良預后相關，且ANGPTL 3 與ECE-1表達之間呈正相關，提示ANGPTL 3 和ECE-1 可能在EC 發生、發展過程中發揮協同作用，且均具有作為EC 患者病情評估、預后判斷及治療靶點的潛能。