樺褐孔菌多糖的提取工藝優(yōu)化及對人肝癌細(xì)胞HepG2脂肪堆積的影響

張蕾 郝婧瑋 宛春雷 柴軍紅 趙玥 王鑫 王雪

摘要：通過L9（34）正交試驗，通過MTT法選取樺褐孔菌多糖對HepG2細(xì)胞的安全濃度，檢測不同濃度的樺褐孔菌多糖對胞內(nèi)TG蛋白的影響，及樺褐孔菌多糖減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的作用。結(jié)果表明，樺褐孔菌多糖最佳條件為 1 g ∶ 15 mL 的料液比，在溫度30 ℃下提取30 min，超聲功率為480 W。樺褐孔菌多糖可明顯減輕HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，顯著降低細(xì)胞中TG的含量，其中600 mg/L樺褐孔菌多糖對TG的清除率達(dá)24.57%，脂滴數(shù)量明顯減少。說明樺褐孔菌多糖具有良好的體外降脂活性，對脂肪肝有較好的預(yù)防效果。

關(guān)鍵詞：樺褐孔菌;多糖;HepG2細(xì)胞;甘油三酯;脂肪堆積;清除率;脂滴數(shù)量

中圖分類號： R284? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0201-04

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的主要特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的變性以及脂質(zhì)的貯積，但同時無過量飲酒史的臨床病理綜合征[1]。經(jīng)常伴有中心性的肥胖、高血脂癥，對胰島素的抵抗能以力及對糖的耐量異常等方面代謝綜合征，嚴(yán)重危害人類的健康[2-4]。近年來，對NAFLD的研究很多，但對其發(fā)病機(jī)制的研究尚不清楚。因此，尋找到有效治療NAFLD的藥物非常重要。

樺褐孔菌（Phaeoporus obliquus J. Schroet），別稱白樺茸，被贊譽(yù)為“西伯利亞靈芝”，為真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱非褐菌目多孔菌科褐臥孔菌屬，是一種非常珍稀而名貴的藥用真菌，生長在溫度相對較低的俄羅斯西伯利亞地區(qū)的原始森林中，不能人工栽培，非常稀少，顏色呈深栗色，常在樹皮破損及傷節(jié)處形成肉瘤狀菌核，菌塊性狀為近球形或不定形塊狀;研究發(fā)現(xiàn)，其化學(xué)成分包含多糖類化合物、芳香物質(zhì)、多酚類化合物、三萜類化合物等物質(zhì)[5-8]，具有重要的藥用價值。從16世紀(jì)至今，樺褐孔菌一直被作為一種民間藥物來治療糖尿病、高血壓、抗衰老等，具有顯著的效果[9-10]。對于非酒精性脂肪肝病的治療，目前還尚未見相關(guān)的研究報道。本試驗通過模擬臨床上NAFLD的病理特點，通過優(yōu)化提取樺褐孔菌多糖提取物，將其作用于HepG2細(xì)胞，從細(xì)胞水平上來評價樺褐孔菌多糖提取物對細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響，以及對細(xì)胞內(nèi)甘油三脂含量的影響，從而揭示其在防治非酒精性脂肪肝方面的藥用價值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

樺褐孔菌購于黑龍江省綏芬河市;MTT、TG試劑盒、油酸、油紅O和細(xì)胞裂解液購于上海源葉生物科技有限公司;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、胰蛋白酶等細(xì)胞試劑購于Hylone公司;乙醇、異丙醇購于北京化工廠;HepG2細(xì)胞筆者所在實驗室傳代保存，由哈爾濱工業(yè)大學(xué)贈送;粉碎機(jī)（戴聲設(shè)備有限公司）、超聲波清洗機(jī)（杭州法蘭特超聲波科技有限公司，總功率800 W）、電子天平（QUINTIX224-1CN Sartorius，R210）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI）、電子顯微成像系統(tǒng)（CX31 Olympus）、酶標(biāo)儀（Synergy HTX BioTek）、靜音混合器（MT-360其林貝爾）。

1.2 樺褐孔菌多糖的提取及測定

將樺褐孔菌粉末過篩，準(zhǔn)確稱取5 g溶于醇濃度為30%的乙醇中，在一定時間、溫度、料液比和超聲波功率下振蕩處理一定時間，用80%乙醇沉淀多糖后，4 000 r/min，離心 7 min 后取上清液，減壓濃縮至浸膏后水浴至干，得粗制多糖，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定其含量。

1.2.1 單因素試驗指標(biāo)對樺褐孔菌多糖提取量的影響 設(shè)計樺褐孔菌多糖提取物單因素試驗的變量條件分別為：提取溫度，20、30、40、50、80 ℃;提取時間，10、20、30、40、50 min;料液比1 g ∶ 8 mL、1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL;超聲功率，160、320、400、480、640 W，從而來確定正交試驗中各因素的水平。

1.2.2 提取工藝正交試驗優(yōu)化 在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用正交試驗表L9（34）進(jìn)行正交試驗，各因素與水平見表1。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法測HepG2細(xì)胞活性

復(fù)蘇HepG2細(xì)胞，將實驗室凍存的HepG2細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放于37 ℃水浴鍋中融化，用PBS清洗后，1 000 r/min 離心去上清后將其放于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：溫度為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度，將培養(yǎng)好的HepG2細(xì)胞每隔1 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并將取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞轉(zhuǎn)于10% FBS的高糖型DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行下一步試驗。

將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并利用細(xì)胞計數(shù)板記數(shù)使每孔細(xì)胞的接種量達(dá)到104個，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，設(shè)對照組和給藥組（樺褐孔菌多糖提取物），給藥組的終濃度分別為6、60、600、6 000、60 000 mg/L，每組設(shè)置3個平行孔，培養(yǎng)24 h;每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續(xù)在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h;取出，緩慢吸去培養(yǎng)液，然后每孔加入100 μL的DMSO，振蕩5～10 min;酶標(biāo)儀 490 nm 處測吸光度。根據(jù)酶標(biāo)儀的吸光度值計算細(xì)胞存活率，選擇存活率達(dá)到70%以上時的樺褐孔菌多糖濃度為安全濃度。

1.4 細(xì)胞內(nèi)TG

檢測蛋白吸附法[11]，樺褐孔菌多糖的給藥濃度分別是600、60、6 mg/L，細(xì)胞內(nèi)的TG含量檢測方法同陳靜等對細(xì)胞內(nèi)TG濃度的測量[12]。

TG清除率=（D模型-D給藥）/D模型×100%。

1.5 油紅O染色

油紅O工作液配制：首先配制0.5%油紅O儲備液，將油紅O粉末溶于異丙醇中，儲備液用蒸餾水稀釋后過濾2次，至液體澄清為止[13]。

將HepG2細(xì)胞接種于24孔板，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出，分為對照組、模型組、低中高濃度（600、60、6 mg/L）樺褐孔菌多糖給藥組，各組所加培養(yǎng)基。孵育24 h后用油紅O工作液染色30 min，蒸餾水吹洗2次，在倒置顯微鏡下觀察染色效果。

1.6 統(tǒng)計分析

通過SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時間、超聲功率、提取溫度、料液比分別對樺褐孔菌多糖提取率的影響

通過對比分析分別改變提取時間、超聲功率、提取溫度、料液比條件下樺褐孔菌多糖類物質(zhì)的提取率，結(jié)果分別顯示，提取時間為30 min、超聲功率為320 W、提取溫度為40 ℃、料液比達(dá)到1 g ∶ 15 mL時，樺褐孔菌中的多糖提取量最大（圖1）。因此，選擇提取時間20～40 min 、超聲功率240～400 W、提取溫度30～50 ℃、料液比1 g ∶ （10～20） mL為進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 樺褐孔菌多糖類物質(zhì)提取的正交優(yōu)化試驗

通過正交試驗確定樺褐孔菌多糖的最佳提取工藝。正交試驗結(jié)果表明，影響樺褐孔菌多糖類物質(zhì)提取率的因素主次順序為D>A>B>C，即超聲功率和超聲時間對樺褐孔菌多糖提取效果影響相對較大，其次為提取溫度、料液比的影響。綜合以上條件，樺褐孔菌多糖的最佳提取條件為A2B2C1D3，即按1 g ∶ 20 mL的料液比在溫度30 ℃下提取30 min，超聲功率為480 W，乙醇濃度為30%進(jìn)行多糖含量測定（表2）。

通過對正交試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，來分析各因素對多糖提取率的影響。結(jié)果表明，提取時間、功率、溫度和料液比對提取率影響顯著（表2）。

2.3 樺褐孔菌多糖的細(xì)胞毒理學(xué)評價

高濃度的藥物對細(xì)胞具有一定的毒性，為了避免此情況的發(fā)生，本試驗通過MTT法檢測樺褐孔菌多糖對細(xì)胞存活率的影響，選取對細(xì)胞毒害作用較小的多糖作為給藥劑。如表3所示，樺褐孔菌多糖濃度為6 mg/L時，細(xì)胞的存活率為9302%;濃度為60 mg/L時，細(xì)胞的存活率為80.04%;濃度為600 mg/L時，細(xì)胞的存活率為68.75%;濃度為6 000 mg/L時，細(xì)胞的存活率為38.06%;濃度為60 000 mg/L時，細(xì)胞的存活率為25.32%。隨著樺褐孔菌多糖濃度的增加，HepG2細(xì)胞的死亡率也在升高，說明樺褐孔菌多糖對細(xì)胞有一定的毒害作用。當(dāng)濃度在600 mg/L以下時，對細(xì)胞毒害作用相對小。因此，將樺褐孔菌多糖的給藥濃度可設(shè)定在6～600 mg/L 之間的安全濃度范圍內(nèi)（表3）。

2.4 樺褐孔菌多糖對HepG2細(xì)胞TG含量的影響

為了減少高濃度的樺褐孔菌多糖對細(xì)胞的毒害作用，試驗選取了600 mg/L以下的樺褐孔菌多糖濃度，測定不同濃度對HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型TG含量的影響。表4所示，模型組與對照組相比，TG含量顯著增加（P<0.05），表明HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型成功建立[12]。60 mg/L樺褐孔菌多糖組與模型組相比，TG含量具有顯著性差異（P<0.05）;600 mg/L樺褐孔菌多糖組與模型組相比，TG含量具有顯著性差異（P<0.01），并隨樺褐孔菌多糖濃度的升高，TG的清除率也逐漸升高，具有明顯的劑量依賴性，其中高濃度組 600 mg/L 樺褐孔菌多糖對細(xì)胞內(nèi)TG的清除效果最好，其清除率達(dá)到24.57%。

2.5 樺褐孔菌多糖減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的作用

樺褐孔菌多糖對油紅O染色的細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響見圖2，與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的紅色脂滴，同時伴隨相互融合現(xiàn)象，說明試驗成功建立了細(xì)胞脂肪堆積模型[12]，并隨著樺褐孔菌多糖濃度的提高，HepG2細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴數(shù)目逐漸減少，且脂滴變小。在3個濃度樺褐孔菌多糖給藥組中，低濃度給藥組的作用效果不明顯;與模型組相比，中濃度給藥組對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積稍有改善，明顯減輕了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)相互融合的現(xiàn)象;高濃度給藥組可明顯減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積現(xiàn)象，且脂滴數(shù)目顯著減少，這與陳靜等研究人參多糖Rb1對HepG2細(xì)胞脂肪堆積影響結(jié)果[12]相似。本試驗結(jié)果說明樺褐孔菌多糖對體外降脂有一定的作用效果。

3 討論與結(jié)論

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害人類健康的世界性疾病。NAFLD是導(dǎo)致肝功能異常的主要原因，肝臟脂肪積聚是其典型特征，但并不能用單一的機(jī)制來解釋其發(fā)病的機(jī)制。TG是NAFLD患者肝臟內(nèi)蓄積的主要脂質(zhì)，是由體內(nèi)TG合成與轉(zhuǎn)化失衡的結(jié)果[13]。

HepG2細(xì)胞已經(jīng)被成功用于脂肪肝細(xì)胞模型的建立，且長鏈脂肪酸能夠使HepG2細(xì)胞內(nèi)形成明顯的脂滴，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)脂肪的堆積。因為游離脂肪酸中含量最高的是油酸，所以選擇油酸來誘導(dǎo)建立肝細(xì)胞脂肪堆積模型，是符合NAFLD形成的病理生理過程的[14]。因此，本試驗采用以上誘導(dǎo)方法，在單因素的基礎(chǔ)上通過正交試驗得到樺褐孔菌多糖的最佳提取條件，將提取的樺褐孔菌多糖提取物作用于HepG2細(xì)胞，并選擇NAFLD的常規(guī)檢測指標(biāo)來評價樺褐孔菌多糖對細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積的作用效果。試驗結(jié)果表明，600 mg/L 樺褐孔菌多糖組的效果最顯著，TG含量與模型組比較差異極顯著（P<0.01），對細(xì)胞內(nèi)TG的清除率可達(dá)

2457%，并且具有劑量依賴性。說明樺褐孔菌多糖提取物具有一定的清除細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積的作用，推測其在脂肪肝治療方面也具有潛在的藥用價值，但目前對于樺褐孔菌多糖降脂機(jī)制還不明確，具體的降脂機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。