滋水涵木通絡法治療肝腎不足型斑禿療效及Th17/Treg相關機制研究

李津津，張雪竹

（天津中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科，天津 300193）

斑禿是皮膚科常見病，表現為突然發生的局限性毛發脫落。在中醫古籍中，斑禿常被稱為“油風”，由肝腎不足、氣血虧虛等原因引起，肝腎不足是其主要病因。西醫認為該病與精神因素、免疫功能、遺傳原因等有關[1]。近期研究提示，斑禿是T淋巴細胞介導的器官特異性自身免疫性疾病，患處可見T細胞浸潤及炎癥因子的釋放，導致毛囊破壞、毛發脫落[2]。輔助 T 細胞 17（Th17）及調節 T 細胞（Treg）均為新近發現的CD4+T細胞亞群。兩者起源相同，但功能卻相互拮抗。Th17促進炎癥反應，通過分泌白介素（IL）-17、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子在炎癥和自身免疫性疾病中發揮重要作用[3]。而Treg能抑制炎癥反應，通過控制免疫應答的強度，防止過度免疫所致的組織損傷來維持機體的免疫穩態[4]。Th17和Treg之間功能的失衡與多種自身免疫性疾病密切相關。

筆者采用滋水涵木通絡法治療肝腎不足型斑禿，臨床效果良好。本文擬從Th17/Treg功能角度，探討滋水涵木通絡法治療肝腎不足型斑禿的機制，為促進中藥療法進一步推廣應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（All-in-one First-Strand cDNA Synthesis Kit）、熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）反應試劑盒均購自北京康為世紀有限公司。酶聯反應吸附（ELISA）試劑盒購自德國IBL公司。所用儀器為ABI7500型熒光定量PCR儀、MD酶標儀等。

1.2 一般資料 66例研究病例均來自天津中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科門診。其中男30例，女36例，年齡18~55歲，平均年齡38.61歲。

1.3 診斷標準 西醫診斷標準：參照《中藥新藥臨床研究指導原則》“中藥新藥治療禿發癥的臨床研究指導原則”，標準如下：1）突然或短期內頭發片狀脫落，單發或多發。2）脫發區皮色正常，無明顯炎癥反應。3）脫發區皮膚未見萎縮及瘢痕。中醫證型診斷標準：參照《中醫外科學》中的辨證分型標準[5]。肝腎不足證：患者平日毛發質量偏黃或偏白，突然成片狀脫發，以中青年患者為主，常伴有心情抑郁，煩躁，工作生活緊張，易怒，腰膝酸軟，眩暈耳鳴，易疲勞，舌紅苔薄白，脈弦細。

1.4 納入標準 1）年齡在18~60周歲，性別不限。2）符合診斷標準。3）自愿接受本治療方案并簽署知情同意書。

1.5 排除標準 1）不符合納入標準的患者。2）真菌性脫發、化療性脫發、藥物性脫發、女性產后脫發、癥狀性脫發、內分泌性脫發（如甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能低下、性腺功能減退、甲狀旁腺功能低下、垂體功能低下、糖尿病等）。3）合并心腦血管病、血液系統疾病、肝臟腎臟疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤及精神疾病等基礎疾病。4）不按規定時間服藥及復診者，影響療效或安全性判斷者，資料不全或無法判定療效者。5）哺乳期或妊娠期婦女。

1.6 剔除標準 1）依從性差，無法正常完成臨床觀察者。2）不按時服用藥物者。3）不按時復診者。4）私自服用或外用其他藥物影響療效判斷者。5）突發其他疾病必須終止治療者。6）自動停止治療或因故失訪者。

1.7 研究方法 將符合納入標準的66例受試者，給予口服本院自擬滋水涵木通絡湯劑（熟地黃30 g，山茱萸10 g，制何首烏30 g，菟絲子10 g，杜仲10 g，黃精 10 g，五味子 10 g，枸杞子 15 g，雞血藤 30 g，女貞子 10 g，墨旱蓮 10 g，桑椹 10 g，天麻 10 g，葛根10 g，桑寄生 10 g，丹參 15 g，柴胡 10 g，郁金 10 g，珍珠母 20 g，澤瀉 10 g，甘草 6 g），每日 1 劑，水煎服，持續12周，期間不給予任何外用藥物治療。用藥前及服藥12周后采集靜脈血，并進行療效評價。同時采集30名年齡、性別匹配的正常人外周血，作為正常對照，以評價用藥前后患者外周血相關指標的變化。

1.8 療效評定標準 參照衛生部1997年發布的《中藥新藥臨床研究指導原則》中關于脫發的療效判定標準[6]。

1.8.1 主要觀察項目 觀察患者毛發的密度、粗細、色澤、油膩、再生情況以及拉發試驗。1）脫發區新生毛發密度與健發區無差別0分；稍較健發區稀疏1分，較健發區稀疏2分，明顯較健發區稀疏3分。2）脫發區新生毛發粗細與健發區無差別0分，稍較健發區細軟1分，較健發區細軟2分，明顯較健發區細軟3分。3）脫發區新生毛發色澤色黑0分，色褐1分，色灰或黃2分，色白3分。4）脫發區新生毛發再生情況100%，不脫0分；大于70%且小于95%，不脫1分；大于30%且小于70%，不脫2分；小于30%或仍脫落3分。輕拉發試驗，陰性0分，陽性1分。

1.8.2 療效評價 臨床痊愈：毛發停止脫落，脫發區毛發全部長出，其分布密度、粗細、色澤與健發區相同，療效指數>90%；顯效：毛發停止脫落，脫發區毛發再生率達70%以上，其密度、粗細及色澤均接近健發區，60%<療效指數≤90%；有效：毛發停止脫落，脫發區毛發再生率達30%以上，包括毳毛及白發長出，30%<療效指數≤60%；無效：脫發再生不足30%或仍繼續脫落，療效指數≤30%。

1.9 PCR法測定血中維甲酸相關核孤兒受體γt（RORγt）和叉頭框蛋白（Foxp3）mRNA的水平 取健康人及患者新鮮血液1.5 mL，依試劑盒說明書提取總RNA，將2μL總RNA逆轉錄為cDNA。將cDNA加入到含有上下游引物、熒光染料的反應體系中，進行擴增和檢測。引物由上海生工合成。Foxp3的引物序列為 5’-CACCCAGGAAAGACAGCAACC-3’和5’-GCAAGAGCTCTTGTCCATTGA-3’；RORγt的引物 序 列 為 5’-ACCTCCACTGCCAGCTGTGTGCTGTC-3 和 5’TCATTTCTGCACTTCTGCATGTAGACTGTCCC-3’；GAPDH 引物 序列為 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。PCR擴增條件為：95℃預變性 5 min；95 ℃ 10 s、50 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，進行40個循環。反應結束，2-△△CT法分析結果，計算目的基因相對于參比基因GAPDH的表達情況。

1.10 酶聯免疫吸附（ELISA）法測定細胞因子水平依試劑盒說明書，檢測血清中Th17相關細胞因子IL-17A和Treg相關細胞因子轉化生長因子β1（TGF-β1）的水平。

1.11 統計方法 使用SPSS 19.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組內比較采用配對樣本t檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者治療前后積分比較 健康人及患者年齡、性別無統計學差異，組間具有可比性，見表1。所有患者均完成12周的臨床試驗觀察，治療前后的積分分別為（11.85±2.08）分和（3.30±0.94）分，兩者比較有顯著性（P<0.01）。提示滋水涵木通絡湯劑能有效治療斑禿。

2.2 有效率分析 經治療，多數患者脫發區長出新生毛發，色澤棕黑，較為致密。患者中有14例痊愈，32例顯效，18例有效，2例無效，總有效率為96.97%。

表1 基線情況Tab.1 Baseline characteristics

2.3 患者治療前后RORγt和Foxp3 mRNA水平的變化 與健康人相比，患者治療前RORγt mRNA水平明顯升高（P<0.01）；而Foxp3 mRNA水平明顯降低（P<0.001）。經過治療，患者RORγt和Foxp3 mRNA水平均改善，與治療前相比有顯著性差異（P<0.01），見表 2。

表2 治療前后血中RORγt和Foxp3 mRNA的水平（x±s）Tab.2 Levels of RORγt and Foxp3 mRNA in the blood before and after treatment（x±s）

2.4 患者治療前后細胞因子水平的變化 與正常人相比，患者血清中IL-17A水平顯著升高（P<0.01）；而TGF-β1水平明顯下降（P<0.01）。經過治療，患者血清中IL-17A和TGF-β1水平均有顯著性差異，與治療前相比有顯著性差異（P<0.01），見表3。

表3 治療前后細胞因子的水平（x±s）Tab.3 Cytokine levels in the serum before and after treatmen（tx±s）pg/mL

3 討論

斑禿在中醫學屬于“油風脫發”范疇，可發生于任何年齡，但以青壯年居多，可逐漸自愈，亦能反復發作，隨長隨落，經久不愈。臨床上針對斑禿的病因病機（肝腎不足、血熱風燥、氣滯血瘀、氣血虧虛等），治以滋補肝腎、益氣補血、活血祛風等法。此外，也有針灸治療斑禿的報道。斑禿是中醫優勢病種，中藥治療不良反應小，成本低，安全性好，長期治療患者易于接受。但是外用藥容易揮發，針刺治療需要病人每日前來就診，患者依從性差。因此，采用方劑口服治療是較為合適的治療方法。

臨床斑禿患者多數表現出平素頭發焦黃或花白，發病時呈大片均勻脫落，伴頭昏耳鳴，目眩，腰膝酸軟，舌淡，苔薄白，脈細數等肝腎不足的現象。腎藏精，腎中精氣的盛衰是機體生、長、壯、老、已的根本，機體齒、骨、發的生長狀態是觀察腎中精氣的外候。腎精化生元氣，元氣可外達肌腠皮毛，具有溫煦和激發皮膚毛發生長的功能。肝主疏泄，當肝失疏泄，氣機郁結時，導致全身氣血運行不暢，毛發營養的供應受阻。血營養全身組織和器官，同樣對毛發起營養作用，血的運行，必須要在氣的推動下，上注于肺，行于經脈之中，均勻布散于全身。“發為血之余”，血氣旺盛，則毛發也旺盛，因此在臨床采用滋水涵木通絡法對斑禿加以治療。“滋水”即補益腎精，“涵木”即寓補肝于補腎之中。主在補腎，協調在肝腎。經絡是人體氣血運行的通路，能將營養物質輸布到全身各個組織器官。方中熟地黃、制何首烏、雞血藤為君藥，旨在滋補腎精，濡養肝血，疏通脈絡。山茱萸、菟絲子、杜仲、黃精、枸杞子、女貞子、墨旱蓮、桑椹、桑寄生、丹參為臣藥，共同輔助君藥，增強其滋腎養肝通絡之功效。五味子、珍珠母、澤瀉、柴胡、郁金為佐藥。天麻、葛根、甘草為使藥。因肝腎不足容易導致肝陽偏亢，肝腎不足也會影響心脾導致血脈運行差，因此方中添加了平肝通絡之品，在注重補益肝腎的同時，還側重平肝陽、通經絡，臨床應用取得良好療效。

近年研究顯示，斑禿是T細胞介導的器官特異性自身免疫性疾病，患處可見T細胞浸潤及炎癥因子的釋放，導致毛囊破壞、毛發脫落[2]。Th17和Treg細胞均為新近發現的CD4+T細胞亞群。兩者起源相同，但功能卻相互拮抗。Th17促進炎癥反應，通過分泌IL-17、IL-6、TNFα等炎癥因子在炎癥和自身免疫性疾病中發揮重要作用[3]。其中IL-17最為重要，機體適應性免疫系統通過IL-17和先天免疫系統相聯系，促進炎癥反應過程。IL-17能誘導IL-6、TNF-α等炎癥因子大量釋放，引起組織浸潤和破壞；并與IL-6、TNF-α等產生協同作用，放大炎癥效應。RORγt是Th17重要的轉錄因子，能促進Th17增殖分化并調節Th17的功能。而Treg能抑制炎癥反應，通過控制免疫應答的強度，防止過度免疫所致的組織損傷來維持機體的免疫穩態[4]。Treg不僅直接抑制效應T細胞的活化增殖及IL-2、γ干擾素（IFNγ）等炎癥因子的分泌；還通過表達TGF-β等抗炎因子來抑制效應T細胞的活性。Foxp3是Treg細胞的關鍵轉錄因子，對Treg功能的維持有重要作用。Th17和Treg兩者之間功能的失衡是多種自身免疫性疾病及炎性疾病發生發展的關鍵原因。研究顯示，斑禿患者血清Th17水平較高，而Treg水平較低[7]；脫發處毛囊周圍有Th17細胞浸潤[8]；而Treg細胞明顯減少[9]。本研究結果也發現，患者血液中RORγt mRNA表達和致炎因子IL-17A的濃度較正常人升高，而Foxp3 mRNA和抗炎因子TGF-β1水平下降。提示患者體內Th17細胞功能增強，而Treg細胞功能下降，體內環境處于免疫調節失衡狀態。經藥物治療后，上述情況得以好轉。說明滋水涵木通絡法治療斑禿能降低患者體內過度活化的免疫反應，減輕局部炎癥損傷，起到保護毛囊、抑制脫發的作用。

綜上，斑禿的發病可能與Th17/Treg細胞間功能失衡有關，滋水涵木通絡法通過調節患者體內Th17/Treg細胞的免疫功能及與兩者相關的致炎與抗炎因子水平，來抑制過度活化的免疫炎癥反應，進而促進毛發生長。