伸筋易骨法調控軟骨細胞內鈣離子濃度干預細胞代謝的機制研究*

馬銘華，王一洲，趙 強

（天津市中醫藥研究院附屬醫院，天津 300120）

膝骨性關節炎（KOA）是臨床最常見的退行性骨關節疾病，初期以關節滑膜病變為主，隨著滑膜內環境失穩和關節應力重構的不斷發生，細胞外基質被破壞，進而影響軟骨細胞的生長環境[1]。軟骨組織是由軟骨細胞和細胞外基質組成的一種致密結締組織，軟骨基質內包含有大量的Ⅱ型膠原纖維和蛋白多糖，這兩種生物分子使軟骨組織具備足夠的粘彈性，同時也形成了軟骨細胞特殊的代謝環境[2]。體內環境下，軟骨細胞的增殖分化非常緩慢，軟骨細胞通過細胞膜表面的離子通道和框架蛋白響應關節內微應力環境調控細胞分泌基質的功能[3]，而鈣離子（Ca2+）作為第二信使是連接細胞內外的重要信息素。前期研究發現[4]，軟骨細胞內L型、P/Q型電壓依賴性鈣通道蛋白亞單位Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4、Cav2.1的表達受應力環境調控。本研究通過激光共聚焦顯微鏡和膜片鉗技術繼續深入挖掘推拿手法調控L型電壓依賴性鈣通道影響軟骨細胞內Ca2+濃度，促進細胞合成代謝的機制，為此類物理治療發揮作用的可能機制提供依據。

1 材料和方法

1.1 試劑 DMEM（Hyclone公司，美國）；TRYPSIN 0.25%EDTA、雙抗（Gibco公司，美國）；FBS（ExCell公司，中國）Ⅱ型膠原酶、5-溴脫氧尿嘧啶核苷、Trypsin（Sigma公司，美國）；CsCl（Amresco公司，美國）；L-Aspartic acid potassium salt、EGTA（Fluka Biochemika公司，美國）；Ca2+探針（索萊寶公司，中國）。

1.2 儀器設備 BZY-DG007型鼠兔跑臺（東莞博之遠生物科技發展有限公司，中國）；BY-80C型醫用離心機（北京白洋醫療器械公司，中國）；PC-100型微電極拉制器（Narishige公司，日本）；低溫離心機（Eppendorf公司，德國）MC1000e三維手動微操縱器（SD公司，美國）Digidata 1322A型AID-DIA轉換器（Axon公司，美國）；pCLAMP 9.0軟件（Sigma公司，美國）。

1.3 分組及處理 （6.23±0.51）月齡雌性日本大耳白兔 50只[SYXK（京）2014-0003]，平均體質量（3.17±0.31）kg，運用改良的 Hulth 造模法[5]模擬應力失常誘導的KOA，編號并隨機均分為5組，造模成功后，治療組以伸筋易骨法治療，對照組以關節腔注射玻璃酸鈉注射液治療，假手術組在脛骨內側髁內上打開2 cm左右創口，鈍性分離直至暴露關節腔后，不做處理，閉合關節腔，并逐層縫合，假手術組、模型組造模成功后與空白組及其他各組同條件飼養，治療結束后取材，機械-酶法分離軟骨細胞[6]。

1.4 治療方法 治療方法如下[7]：1）應用自制固定器將兔仰臥位固定，指揉法作用于足陽明胃經、足少陽膽經、足太陽膀胱經各約5 min。2）以點按法作用于血海、梁丘、犢鼻、足三里、陽陵泉、委中、承山穴，每穴1 min。3）以指推法從髂前上棘自上而下推至髕骨上緣，操作9遍。4）屈髖屈膝90°，以搖法順時針操作9遍；將髖關節外展至極限，行膝關節拔伸法，直至膝關節伸直，操作9遍。4）沿膝關節內外側從前至后行擦法1 min，結束手法。上述手法1次/日，共治療21 d。對照組治療方法如下：1）應用自制固定器將兔仰臥位固定，術區常規消毒備皮。2）髕旁入路，造模側膝關節注入玻璃酸鈉注射液1 mL。3）屈伸膝關節數次以使藥液充分覆蓋關節，紗布蒙蓋注射區。上述治療每周1次，共治療3周。

1.5 激光共聚焦顯微鏡檢測細胞Ca2+濃度 將分離的原代軟骨細胞放入培養孔，預置細胞爬片，待第2天鏡下觀察細胞部分貼壁后進行以下操作：1）向Fluo-4，AM/DMSO溶液中加入16.5 mg Pluronic F127（Pluronic F127可以防止Fluo-4，AM在HBSS中聚合并能幫助其進入細胞）。2）用HBSS稀釋Fluo-4，AM溶液，制備 4μmol/L的 Fluo-4，AM 工作液。3）吸出培養基至剩余約50μL，加入約1 mL PBS，清洗細胞孔。剩余約50μL磷酸鹽緩沖液（PBS），再次加入1 mL PBS清洗。4）盡量移去上清，迅速將Fluo-4，AM工作液加入培養孔（約100μL），在37℃培養30 min。5）加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS中和，再繼續培養40 min。6）用HBSS洗滌3次。7）37℃下培養10 min，制作臨時裝片，然后用顯微鏡進行熒光Ca2+檢測。激發波長494 nm，發射波長516 nm。

1.6 軟骨細胞電生理檢測 將分離好的原代軟骨細胞懸浮于配置好的培養液中，培養液底部放置5片載玻片，培養箱中靜置預爬片，取出載玻片，鏡下選取貼壁良好、形態正常的軟骨細胞進行檢測。通過pClampex9.2軟件進行軟骨細胞離子通道電流的采集。將拉置好的微電極灌入預調PH為7.2的電極液（CsCl 125 mmol/L、TEA-Cl 10 mmol/L、MgCl21 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、Mg-ATP 5 mmol/L、HEPES 5 mmol/L）并連接在顯微鏡的探頭上，此時電阻在2-4 MΩ之間。將負載目標細胞的載玻片置于事先配置好的細胞外液中（N-methyl-D-glucamine 140 mmol/L、MgCl21 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、glucose 10 mmol/L），下降電極進入液面并在與細胞接觸前補償尖端電位。形成高阻封接（>1 GΩ）后，負壓抽吸破膜，形成全細胞構型，在電壓鉗模式下進行刺激和記錄。鈣電流（ICa）的記錄：鉗制電位從-40 mV以10 mV為階躍至70 mV，測定200 ms的電流穩態值；實驗過程由計算機軟件pClamp9.2（Axon Instrument）控制數-模轉換器完成采集和分析。

1.7 統計學方法 所有數據輸入SPSS 19.0軟件進行分析，計數資料用均數+標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組軟骨細胞內Ca2+平均熒光強度比較見圖1、表1。由圖1可見，激光共聚焦熒光Ca2+檢測中細胞內Ca2+呈綠色熒光染色，模型組與空白組、假手術組相比熒光強度較暗，治療組和對照組熒光強度較模型組略強，但較空白組和假手術組稍暗。表1可知，模型組與空白組的Ca2+平均熒光強度值，有顯著性差異（P＜0.05），對照組與模型組的Ca2+平均熒光強度值比較有顯著性差異（P＜0.05），治療組與模型組的Ca2+平均熒光強度值比較具有顯著性差異（P＜0.05），對照組與治療組的Ca2+平均熒光強度值比較無統計學意義（P＞0.05）。提示膝關節應力失常會影響原代軟骨細胞Ca2+的跨膜轉運，減少細胞內的Ca2+濃度，伸筋易骨法和玻璃酸鈉關節腔注射可促進Ca2+內流，增加軟骨細胞內的Ca2+濃度。

各組軟骨細胞L型鈣通道電流密度見圖2、表2。各組軟骨細胞L型鈣通道電流由膜片鉗檢測形成不同電流密度的軌跡圖，由圖2可見，模型組與空白組、假手術組相比電流密度較低，治療組和對照組電流密度較模型組高，但較空白組和假手術組低。由表2可知，模型組與空白組軟骨細胞L型鈣通道電流密度有顯著性差異（P＜0.05），對照組與模型組軟骨細胞L型鈣通道電流密度有顯著性差異（P＜0.05），治療組與模型組軟骨細胞L型鈣通道電流密度有顯著性差異（P＜0.05），對照組與治療組軟骨細胞L型鈣通道電流密度無統計學意義（P＞0.05）。提示膝關節應力失常會抑制軟骨細胞L型鈣通道的活性，降低Ca2+內流，進而影響軟骨細胞的合成代謝，伸筋易骨法和玻璃酸鈉關節腔注射能夠通過活化L型鈣通道，提高軟骨細胞膜對Ca2+通透性，增加軟骨細胞內Ca2+濃度，啟動Ca2+依賴的合成代謝相關蛋白，改善關節軟骨細胞的分泌功能，調節軟骨和細胞外基質的應力重構。

圖1 各組軟骨細胞染色強度（激光共聚焦顯微鏡，免疫熒光染色，×200、×400）Fig.1 Staining intensity of chondrocytes in each group（laser confocal microscopy，immunofluorescence staining，×200，×400）

3 結論

關節應力失常會抑制軟骨細胞L型鈣通道的活性，降低Ca2+內流，造成細胞內鈣耗竭，影響軟骨細胞分泌和合成代謝[8]。伸筋易骨法和玻璃酸鈉關節腔注射均能夠活化L型鈣通道，提高軟骨細胞膜對Ca2+通透性，增加軟骨細胞內Ca2+濃度。結合前期研究基礎，推測伸筋易骨法通過調節關節周圍軟組織性能，降低細胞表面應力集中，軟骨外基質的結構形態改變將力學信號傳導至細胞表面，并影響軟骨細胞周圍陽離子濃度，提高軟骨細胞膜的靜息膜電位[9]，活化軟骨細胞表面L型鈣通道。伸筋易骨法調節下肢整體應力，改善關節微應力環境，從遠期療效考慮其效果優于玻璃酸鈉關節腔注射。

表1 各組軟骨細胞內Ca2+平均熒光強度比較（x±s）Tab.1 Comparison of average fluorescence intensity of Ca2+in chondrocytes of each group（x±s）

圖2 兔軟骨細胞L型鈣通道電流軌跡圖（-40-50 mV）Fig.2 Current trajectory of L-type calcium channel in rabbit chondrocytes（-40-50 mV）

表2 各組軟骨細胞L型鈣通道電流密度（x±s）Tab.2 Current Density of L-type Calcium Channel in Chondrocyte of each group（x±s）

3 討論

KOA的病因目前尚未明確，但關節軟骨的結構和性能改變是KOA發生、發展和關節應力重構中最重要的一環。有研究表明[10]，應力的強度、頻率、載荷方式均會影響軟骨細胞的生理功能，提升關節周圍肌肉、韌帶、滑膜等軟組織的力學性能，成為保護軟骨組織的重要途徑。

伸筋易骨法是趙強主任以筋骨并重為手法核心創制的一套KOA手法操作方案，伸筋易骨法重點選用足陽明胃經、足太陰脾經及兩經穴點進行手法刺激，達到健脾益胃、化食為能的作用，脾氣充盛，則能筋伸骨正。手法操作通過揉、等手法作用于股直肌、股二頭肌等淺部肌群，通過點、按法作用于腱-骨結合部以刺激深部肌群，同時彈撥肌腹增加筋膜間血液的流速，運用搖法、拔伸法等運動關節類手法刺激滑膜、韌帶。整套手法以膝關節周圍軟組織作為作用靶點，以恢復關節應力環境為目的，發揮調筋治骨的作用。

近年來，筆者通過動物實驗逐步挖掘該手法的作用特點和內涵，綜合前期研究筆者認為，伸筋易骨法通過調節膝關節周圍軟組織性能，改善關節微應力環境，調控軟骨細胞表面離子通道，增加細胞內Ca2+濃度，激活下游合成代謝相關蛋白，緩解KOA患者軟骨組織的損傷。未來筆者將更進一步對推拿手法等物理治療的力學-生物信號轉導機制進行挖掘，為退行性骨關節病的防治研究作出貢獻。