炮制對小茴香中黃酮成分的影響*

李 敏，竇志英，柴 欣，王躍飛，楊 靜

（天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津市現代中藥重點實驗室，天津 301617）

小茴香為傘形科植物茴香（Foeniculum vulgare Mill.）的干燥成熟果實，主產于甘肅、寧夏、新疆、內蒙古等省[1]，是一種藥食同源的植物。其性溫，味辛，有散寒止痛、理氣和胃的功效；主要用于治療寒疝腹痛，睪丸偏墜，痛經，少腹冷痛，脘腹脹痛，食少吐瀉，睪丸鞘膜積液等[2]。鹽小茴香是小茴香采用鹽水炙法炒至微黃色，具有暖腎散寒止痛之功效[3]。

小茴香的化學成分主要包括揮發性成分和非揮發性成分。揮發性成分是小茴香的重要活性成分，占3%~6%[4]，主要包括單萜、倍半萜及含氧化合物，其中反式-茴香腦、愛草腦、L-葑酮、D-檸檬烯是小茴香主要揮發性成分，具有抗炎、鎮痛、抑菌、保肝、促滲、降血糖、抗癌等作用[5-8]。非揮發性成分主要包括酚酸和黃酮類成分，酚酸類化合物具有抗氧化作用，可以清除氧自由基，減輕對機體的損傷[9]；黃酮類成分具有多種活性，紫丁香苷（SG）具有抗炎、抗輻射、抗癌、增強記憶力、緩解疲勞等作用[10]；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（QG）具有抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗病毒等活性[11-12]。

2015年版《中華人民共和國藥典》采用氣相色譜法測定了揮發性成分反式茴香腦，未開展小茴香中非揮發性成分的分析。本研究以SG、QG為指標成分，系統研究鹽制小茴香炮制過程中指標成分的變化規律以及市售小茴香中指標成分的含量分布情況，為小茴香質量控制及炮制研究提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器 超高效液相色譜儀：Waters ACQUITYTMUPLC system（美國沃特世公司），XS 205型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），AL 204型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），DL-180E型智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司，功率180 W，頻率50 kHz），TGL-16C型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），Milli-Q型超純水系統（美國Millipore公司），HYC-940醫用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司），C21-WK2102多功能電磁爐（Midea公司），CKN4634BF-無油煙炒鍋（浙江炊大王炊具有限公司）。

1.2 藥品與試劑 紫丁香苷（111574-201605）購自中國食品藥品檢定研究院、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（R24S7F21842）購自上海源葉生物科技有限公司。

小茴香：16批藥材購自河北安國、安徽亳州等大型中藥材交易市場，樣品編號S-1~S-10（生小茴香）；Y-1~Y-6（鹽小茴香）。生品小茴香 S-10（購自河北春開制藥股份有限公司，產地：內蒙古）用于鹽小茴香的炮制研究。所有樣品均由天津中醫藥大學李天祥教授鑒定為傘形科植物茴香（Foeniculum Vulgaer Mill.）的干燥成熟果實。

甲醇為色譜純，甲酸為分析純，水為超純水；食用鹽（蘆花，天津長蘆漢沽鹽場有限責任公司）。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～7 min，5%→36.5%B；7～12 min，36.5%→85%B）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：2 μL。

2.2 對照品溶液制備 分別取SG、QG標準品適量，精密稱定，配制成濃度分別為99.30μg/mL、123.76μg/mL的混合對照品溶液，置于4℃冰箱中，備用。

2.3 供試品溶液制備 取小茴香藥材粉末0.5 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加適量50%甲醇，超聲處理（頻率50 kHz）20 min，放至室溫，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，14 000 rpm離心10 min，取上清液，過濾，取續濾液1 mL，加1 mL蒸餾水，混勻，即得供試品溶液。

2.4 鹽小茴香炮制研究 取生小茴香藥材1 kg，置于炒鍋中，均勻翻炒，炒至微顯火色，噴淋鹽水溶液繼續翻炒至微干，取出，放涼，即得。本研究系統考察了小茴香鹽炙過程中的鹽水比例（20 g分別溶解于 60、80、100 mL 水中獲得 33.33%、25%、20%的鹽水溶液；即鹽水比例 1∶3、1∶4、1∶5）、炮制溫度（130~160℃、180~200℃、200~240℃）、炮制時間（10 min、15 min、20 min、25 min）對鹽小茴香中指標成分的影響（用鹽量參照2015版《中華人民共和國藥典》四部通則“0213炮制通則”，鹽炙法中規定每100 kg待炮制品用食鹽2 kg）。

3 結果與討論

3.1 小茴香中SG、QG含量測定的方法學研究

3.1.1 供試品溶液制備方法的優選 系統考察了提取時間（20、30、40 min）、料液比（1∶25、1∶50、1∶100）、提取溶劑（25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇）對SG、QG提取效率的影響。每個提取條件平行制備兩份樣品（n=2），每份樣品平行進樣兩次，以優選最佳的供試品溶液制備方法。結果表明，采用50%甲醇作為提取溶劑時，SG、QG的含量分別為1.194、1.233 mg/g，明顯優于25%甲醇、75%甲醇、甲醇的提取效果；超聲提取20 min時，SG、QG的含量分別為1.267、1.591 mg/g，明顯優于超聲處理10 min和30 min；提取溶劑的用量基本不影響小茴香中指標成分的提取效率，故最終選擇25 mL。因此，確定供試品最優制備方法，如“2.3”項下供試品制備方法所述。

3.1.2 小茴香方法學驗證研究 按“2.1”項下色譜條件測定“2.2”項下系列混合對照品溶液，平行進樣2次，以對照品濃度為橫坐標X（μg/mL），以對照品峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線；小茴香中SG、QG在相應濃度范圍內線性關系良好（r＞0.999），檢測限（S/N=3）分別為 0.002 7、0.003 4μg/mL；定量限（S/N=10）分別為 0.008 1、0.010 1 μg/mL；方法學驗證結果均符合含量測定要求，結果如表1所示。

結果表明，SG、QG的日內精密度（相對標準偏差，RSD）分別為0.35%、0.23%，日間精密度RSD分別為1.34%、0.41%；小茴香供試品溶液在10℃條件下放置12 h內穩定性良好，RSD分別為0.45%、0.71%；加樣回收率分別為98.65%、98.31%，RSD分別為1.42%、2.26%；該方法準確可行。

3.2 鹽小茴香炮制工藝研究 系統考察了炮制過程中的鹽水比例、炮制溫度、炮制時間對小茴香中SG、QG含量的影響。采用“2.1”項下色譜條件測定供試品溶液中兩種指標成分的含量，結果如圖1所示。

結果表明，鹽水比例對鹽小茴香中SG、QG的含量基本沒有影響；隨著炮制溫度的升高和炮制時間的延長黃酮類成分的含量逐漸下降，鹽小茴香表面呈焦黑色。因此，結合生產的實際需要，最終確定鹽小茴香的炮制工藝：取生小茴香至炒藥鍋（180~200℃）中，均勻翻炒，炒至微顯火色，噴淋25%鹽水溶液（每100 kg小茴香用食鹽2 kg），繼續炒至微干，炒制時間15~20 min，取出，放涼，即得。

圖1 鹽小茴香炮制工藝優選（n=2）Fig.1 Optimization of the processing technology of salt Fennel（n=2）

表1 SG、QG的線性回歸方程、線性范圍、相關系數、檢測限、定量限、精密度、穩定性、加樣回收率結果Tab.1 Linearity，LOD and LOQ，intra-and inter-day precision，stability，recovery of SG and QG

3.3 市售小茴香中指標成分的分析 為了研究市售小茴香指標成分含量的差異情況，本研究測定不同來源的16批小茴香（10批生小茴香、6批鹽小茴香）。

結果表明，生小茴香中SG的含量為0.840~1.263 mg/g（RSD，13.87%）、QG 的含量為 1.161~2.418 mg/g（RSD，27.48%）；鹽小茴香中 SG 的含量為 0.795~1.170 mg/g（RSD，12.61%）、QG 的含量為1.025~1.520 mg/g（RSD，14.20%）。鹽小茴香中 SG、QG的含量略低于生小茴香，與本研究的結果基本一致。