日本醬油與中國醬油在不同模擬條件下揮發性呈香物質分析

丁莉莉，王 昊，王新宇，潘志輝，趙國忠*

（1.天津科技大學 食品工程與生物技術學院 食品生物技術教育部工程研究中心，天津 300457；2.廣州致美齋食品有限公司，廣東 廣州 510403）

醬油是我國的傳統調味品，也是每家每戶佐餐的必需品，由于其獨特的風味物質和營養成分而被廣為流傳[1-2]。近年來，我國醬油市場發展迅猛，呈現快速增長趨勢，但是高端醬油產品占比較少。目前隨著中國社會的發展及人們消費水平的不斷提高，消費觀念逐漸變化，對醬油的需求也不只是滿足于基本調味功能，而是逐漸走向營養化、健康化、高端化[3]。日本醬油釀造企業也看到了中國龐大的消費群體這一優勢，依靠其優質的產品以及強大的品牌效應，不斷擴大市場份額[4]。其中，日本龜甲萬醬油依靠其獨特的風味和怡人的口感，使其產品暢銷全國各地，并始終處于領先水平。但由于日本用餐習俗、飲食文化、烹飪方式與中國差異明顯，賦予了醬油的不同食用價值[5-7]，也使得醬油在不同的食用條件下，表現出不同的風味屬性。

目前，頂空-固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）技術已被廣泛用于揮發性風味物質的檢測，它是集采樣、萃取、凈化、濃縮、進樣功能于一體的分析檢測技術，可以在一定程度上檢測出醬油中的可揮發性物質的成分和相對含量，使用方便，操作簡單，安全環保[8-9]，對揮發性組分具有很好提取效果。主成分分析（principle componentanalysis，PCA）是一種多元統計分析法，利用PCA分析能降低實驗維度，可將多個變量間的復雜關系轉為較少的幾個變量。既保證原始變量信息的完整性，同時使得分析變得簡單[10]。

為進一步對比研究日本醬油和中國醬油在不同模擬條件下（在模擬蘸料條件下為25℃、在模擬炒菜條件下為95℃）的揮發性呈香物質，并找出兩者具有特征性差異的呈香物質，本研究不使用溶劑萃取方法，而采用無溶劑萃取，即頂空-固相微萃取技術結合氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）進行定性定量檢測，通過PCA進行主成分分析，闡明兩者揮發性呈香物質的差異，揭示中日醬油之間品質、風味之間的區別與聯系，進一步改善中國民族醬油的質量，提升民族自主品牌的競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取日本濃口醬油（3種）、中國傳統醬油（3種，其中1種醬油與日本醬油相近）：所有醬油均為高鹽稀態釀造，購買于網上商城；2-辛醇（純度99%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇（色譜純）：天津泰艾瑞科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質譜聯用儀：日本島津公司；SAAB-57348U 50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭和SAAB-57330U頂空-固相微萃取SPME手動進樣手柄裝置：上海安譜實驗科技股份有限公司；RCT磁力攪拌器：德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 頂空-固相微萃取

量取5 mL醬油樣品，30μL內標（0.125 mg/L的2-辛醇甲醇溶液）于15 mL頂空瓶中，擰好瓶蓋，分別置于不同的模擬條件下25℃、95℃水浴中加熱平衡15 min后，用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在25℃、95℃模擬條件下萃取30 min，萃取結束后在GC進樣口250℃下解極5 min。首次萃取時需將萃取頭老化1 h，以去除萃取頭上所吸附的雜質，防止交叉污染。

1.3.2 GC-MS條件分析

氣相色譜條件：Rtx-5MS毛細色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；程序升溫條件：起始溫度40℃，保持3 min，以4℃/min升至150℃，保持1 min，再以8℃/min升到250℃，保持6 min；載氣為氦氣（He）；流速1.0 mL/min；分流比：10∶1。

質譜條件：離子源溫度200℃；傳輸線溫度220℃；溶劑延遲時間1.5 min；質量掃描范圍35～500 m/z，掃描模式為全掃描。

1.3.3 數據統計分析

化合物的鑒定根據美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）11數據庫進行數據收集，參考相關文獻和譜庫初步鑒定物質成分，結合保留時間，特征離子峰和峰度比進行準確定性，相似度在80%以上的化合物會在文中列出。通過內標（2-辛醇）對醬油中所有揮發性呈香物質進行半定量分析（響應因子=1），每個樣品平行測定3次，取其平均值進行后續分析，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）法對醬油中揮發性呈香物質進行分析。

2 結果與分析

2.1 日本醬油和中國醬油中揮發性呈香物質的鑒定結果分析

在兩種模擬條件下，6種不同品牌的醬油通過HS-SPMEGC-MS方法，經分離鑒定出6種不同品牌的醬油中共有揮發性呈香物質9類，合計325種物質，主要有揮發性醇類、酸類、酯類、醛類、酮類、酚類、呋喃類、吡嗪類和雜環類（包括含氮化合物和含硫化合物）。采用內標物半定量分析法求得各揮發性呈香物質在醬油中的含量和各類呈香物質的總含量，結果如圖1所示。由圖1可以看出，在兩種模擬條件下，隨著溫度的升高，日本品牌醬油中的醇類、酸類、醛類和酚類物質含量變化較大，中國品牌醬油則以酯類、酮類和吡嗪類物質含量變化明顯。

圖1 中日醬油呈香物質比較結果Fig.1 Comparison results of aroma substances in Chinese and Japanese soy sauce samples

2.1.1 日本醬油和中國醬油在25℃條件下揮發性呈香物質的鑒定分析

在25℃條件下，中國醬油共鑒定出131種揮發性呈香物質，日本醬油共鑒定出106種。如圖1所示，在25℃條件下，中國醬油與日本醬油在揮發性醇類、酸類、醛類、酮類、酚類、呋喃類和雜環類等呈香物質的含量相差不大，但吡嗪類物質的含量明顯高于日式，因為吡嗪類的來源是蛋白質或氨基酸的熱分解、蛋白質或氨基酸與糖類發生美拉德反應的產物，造成差異的原因可能是原料不同[11]。由于本文所用的中國品牌醬油是以黃豆和小麥粉為主要原料，而日本品牌醬油的原料則是以脫脂大豆和炒小麥為主，這也與吡嗪類物質的來源分析相一致[12]。其中2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪賦予中國醬油堅果、烤土豆、焙烤類香氣。就揮發性酯類物質而言，日本醬油優于中國醬油，主要貢獻來源于產酯產香的乙基酯類物質，其生成途徑一是在發酵過程中由酵母酶和乳酸菌催化生成[13]，二是由大豆中的蛋白質降解成為氨基酸與乙醇酯化產生[14]。乙基酯類物質具有誘人的果香和甜香，對日本醬油的香味具有很強的貢獻度。

2.1.2 日本醬油和中國醬油在95℃條件下揮發性呈香物質的鑒定分析

在95℃條件下，中國醬油共鑒定出208種揮發性物質，日本醬油共鑒定出143種。如圖1所示，日本醬油中揮發性醇類、酸類、醛類、酚類的含量均高于中國醬油，尤其突出表現為醇類，其含量比中國醬油高出1.6倍。但是，中國醬油在揮發性酯類、酮類、吡嗪類、雜環類的含量均高于日本醬油。在揮發性醇類物質中，乙醇主要是醬油發酵過程中由酵母作用，通過酒精發酵產生的，在高鹽稀態醬油中乙醇主要是酵母菌和糖類通過代謝作用共同產生的[23]，而其他高級醇（如苯乙醇）則是由支鏈氨基酸異亮氨酸和亮氨酸以及芳香族氨基酸苯丙氨酸在代謝過程中脫氨基、脫羧基后產生的[13]。日本醬油中乙醇含量遠高于中國醬油，因此，日本醬油的醇香味更加濃厚怡人。在此條件下，中國醬油在揮發性酯類物質的含量上占據優勢，主要是長鏈的脂肪酸酯類物質，賦予中國醬油濃郁而飽滿的醬香和酯香，來源于原料中的脂肪酸和醇類的相互作用，同時也與大豆油的降解有關[15]。

2.2 日本醬油和中國醬油中典型揮發性呈香物質的結果分析

對6種不同品牌的醬油中典型揮發性呈香物質進行比較分析，在25℃條件下，日本醬油和中國醬油中典型呈香物質的結果分析如表1所示，共確定出39種典型揮發性呈香物質，其中3種日本醬油共鑒定出32種，3種中國醬油共確定出33種。日本醬油中典型呈香物質主要是乙醇，其平均含量約是中國醬油的3倍，主要貢獻醇香和酒香；乙基酯類物質貢獻果香和甜香，兩類物質的總含量遠遠高于中國醬油，這主要是與日本醬油所使用的主要原料、發酵菌種以及高鹽稀態控溫發酵工藝有關[7]。中國醬油中典型呈香物質主要是由苯乙醇貢獻花香和甜香；2-乙酰基吡咯、愈創木酚、糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醇及吡嗪類物質貢獻煙熏香、（燒）烤香、堅果香和醬香，這些物質主要來源于氨基酸的Strecker降解反應，是中國醬油產生濃郁香氣的主要因素[14]。

表1 25℃時醬油中典型呈香物質比較分析Table 1 Comparison and analysis of typical aroma substances in soy sauce at 25℃

續表

在95℃條件下，日本醬油和中國醬油中典型呈香物質的結果分析如表2所示，結果表明，共確定出79種典型揮發性呈香物質，其中3種日本醬油共確定出62種，3種中國醬油共確定出66種。日本醬油中典型呈香醇類主要有乙醇、異丁醇、異戊醇、2-甲基丁醇、正丁醇、2,3-丁二醇（兩種同分異構體）占主體地位，貢獻醇香、麥芽香和果香等芳香氣味，以豐富日本醬油獨特的風味特征，使其醇香味更加濃厚怡人；中國醬油是以糠醇、苯乙醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、麥芽醇和月桂醇為典型，貢獻一定的烤香、花香和果香，以緩和醬油中的不良氣味。醋酸在日本醬油中占有絕對優勢，它是厭氧微生物發酵的產物，說明日本醬油在發酵過程中，厭氧發酵占據一定的比重[16]。典型呈香醛類共確定13種，日本醬油中以α-戊基桂醛和（Z）-7-十六碳烯醛為典型，賦予其一定的果香和烤香；中國醬油以3,4,5-三甲氧基苯甲醛為典型，為其提供一定的甜香和果香。呈香酚類物質主要是曲霉在發酵過程中通過降解作用生成的，主要貢獻給醬油煙熏香和焦糖香味[17]，中國醬油以2,6-二甲氧基苯酚、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚為典型，日本醬油以3,5-二叔丁基苯酚為典型。中國醬油的呈香酯類物質比重占據較大，主要是苯基酯類物質和長鏈脂肪酸乙酯類物質貢獻較突出，賦予醬油良好的果香、醬香和酯香，尤其是乙酸苯乙酯，苯甲酸-2-苯乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、反油酸乙酯；日本醬油以煙酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸異丁酯、2,2-二甲基乙烯基丁酸酯為典型。揮發性呈香酮類物質包含了呋喃酮和吡喃酮類物質，其都是由糖代謝途徑產生的[18]，5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-5-ethyl-2-methyl-3（2H）-furanone，HEMF）是共有的酮類物質，賦予醬油很好的果香、煙草香和焦糖香，中國醬油以2-甲基四氫呋喃-3-酮、1-（6-甲基-2-吡嗪基）乙酮和2,4-二甲氧基苯乙酮為典型；日本醬油以3,6-二甲基四氫吡喃-2-酮和香葉基丙酮為典型。吡嗪類物質是中國醬油中典型呈香成分，貢獻醬油焦香、烤香和堅果香，在已鑒定的8種吡嗪類物質中，2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪是共有物質，其余5種是中國醬油特有的物質。2-乙基-5-甲基呋喃是日本醬油特有，貢獻出焦糖香、醬香；薄荷呋喃和4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（HDMF）是中國醬油特有。D-檸檬烯是日本醬油特有，貢獻出果香[19]。

表2 95℃典型呈香物質比較分析Table 2 Comparison and analysis of typical aroma substances in soy sauce at 95℃

續表

2.3 日本醬油和中國醬油中典型揮發性呈香物質的差異比較分析

通過HS-SPME-GC-MS方法，對比表1和表2發現，在25℃條件和95℃條件下，從6種品牌醬油中共檢測出典型揮發性呈香物質共94種，26種典型呈香物質在兩種條件下均有檢出（表1和表2中的前26種），13種典型呈香物質僅在25℃條件下檢出（表1中的后13種），53種典型呈香物質在95℃條件下檢出（表2中的后53種），由此可見，醬油在不同處理條件下，呈香物質的種類表現出較大的差異性，對中日兩類6種醬油中典型揮發性呈香物質的差異比較分析如圖2所示。

在25℃條件下，對揮發性典型呈香酸類、酮類和呋喃類物質均無檢出，這與低溫條件有關，不利于這幾類物質的提取與檢測，因此揮發性典型呈香物質以酯類和醇類為主。在95℃條件下，揮發性典型呈香物質增高最為明顯的是酮類、酚類和醛類。由此可見，醬油在不同處理條件下，呈香物質的種類差異性較大。

圖2 25℃和95℃條件下醬油典型呈香物質差異分析Fig.2 Difference analysis of typical aroma substances in soy sauce at 25℃and 95℃

在26種共有的典型物質中，呈香醇類物質共有10種，其含量差異也較為突出。在25℃條件下日本醬油中醇類的相對總含量與中國醬油差異較小，而95℃條件下兩類醬油的相對總含量差異極大，尤以乙醇明顯。在兩種萃取條件下，日本醬油中醇類物質平均含量分別約是中國醬油的2.2倍和9倍，乙醇是日本醬油中最為突出的呈香醇類物質，其醇厚的香氣可以調和海產品中的土腥味，有助于增強海鮮類產品的口感，符合日本蘸料的飲食風俗。中國醬油以苯乙醇為典型，苯乙醇是由芳香族氨基酸苯丙氨酸在代謝過程中脫氨基、脫羧基后產生的[20]，在兩種萃取條件下，苯乙醇在中國醬油中的平均含量約是日本醬油的5倍。乙酸乙酯的相對含量在兩類醬油中差異明顯，在日本醬油為典型，乙酸乙酯表現為高揮發性，呈較強烈的果香和酒香，對日本醬油的風味貢獻尤為突出。在高溫萃取時，乳酸乙酯和檸檬酸三乙酯在中國醬油的相對含量高于日本醬油，以此賦予中國醬油綿長醇厚的后味，使其在高溫烹飪時表現出獨有的特性。吡嗪類物質的閾值低，具有特殊堅果和焦糖香氣，對醬油香氣賦予作用較大[21-22]。中國醬油吡嗪物質的含量要遠遠高出日本醬油，賦予中國醬油獨特的后味而應用于更廣泛的烹飪領域。其中2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪是中國醬油區別于日本醬油的關鍵物質。

醬油的醬香風味是多種呈香物質共同作用的結果。中日醬油中在典型揮發性香氣物質如異戊醛、2-甲基丁醛、愈創木酚、HEMF等主要呈香物質相似，但在高溫條件下，日本醬油中HEMF含量約為中國醬油的2倍。日本醬油的典型呈香物質是乙醇、乙酸乙酯等揮發性強的小分子醇類和脂類，這些物質往往具有誘人的果香和獨特的芳香氣味，給人以清香恬淡的感覺。在日本飲食文化和地域環境的影響下，醬油主要作為蘸料被使用，而日本醬油誘人的醬香和怡人的醇香剛好滿足這種飲食需求。但日本醬油中吡嗪類、酮類化合物含量和種類較少，后味缺失，因此使用范圍也受到較大的制約。對于中國醬油，其典型呈香物質源于吡嗪類、酮類和酯類化合物。糠醇、檸檬酸三乙酯、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯是其區別于日本醬油的關鍵物質，它們賦予中國醬油醇厚綿長的后味，在高溫烹飪時展現其特有的醬香風味。

2.4 日本醬油和中國醬油中揮發性呈香物質的主成分分析

為了更加明確地探究中國醬油和日本醬油的典型揮發性呈香物質，對中日兩類的6種醬油中的呈香物質對中日兩種品牌6種醬油中的呈香物質組分進行主成分分析，結果如圖3所示。

圖3 中日醬油呈香物質的主成分聚類分析Fig.3 Principal component cluster analysis of aroma substances in Chinese and Japanese soy sauces

圖中的6個紅色數據點代表中日兩類的6種不同醬油，其中在25℃條件下，第一主成分（PC1）的方差貢獻率為65.40%，貢獻最大的呈香物質是異戊醇，第二主成分（PC2）的方差貢獻率為21.24%，貢獻最大的呈香物質為乙酸乙酯；在95℃條件下，第一主成分（PC1）的方差貢獻率為66.26%，貢獻最大的呈香物質是乙醇，第二主成分（PC2）的方差貢獻率為29.78%，貢獻最大的呈香物質為苯乙醇，在兩種條件下，前兩個主成分的累計方差貢獻率均大于85%，以充分說明了該兩個主成分已包含了樣品的整體數據信息。

由圖3可看出，在兩種條件下，中日兩國的6種醬油被顯著區分成2類，即是中國醬油樣品C1與C3聚為一類，中國醬油樣品C2與日本的三個醬油樣品聚成一類，說明該兩種中國醬油產品C1與C3中的呈香物質較為相近，差異較小；而C2則與日本醬油中的呈香物質較為接近，與C1和C3的呈香物質相差較遠，差異較大。在25℃條件下，中國醬油中的典型呈香物質以苯乙醇，2-甲基丁醇和異戊醇貢獻度為主，日本醬油中的典型呈香物質以乙酸乙酯，乙醇和2-甲基丁醛為主。在95℃條件下，中國醬油中的典型呈香物質以苯乙醇，2-甲氧基-4-乙烯苯酚，異戊醛，2-甲基丁醛和苯乙醛為主，日本醬油中的典型呈香物質以乙醇，異戊醇和4-乙基-2-甲氧基苯酚為主。由此可見，不同品牌醬油中的呈香物質差異較為明顯。

通過該主成分聚類分析圖可以將6種醬油中呈香物質組分間差異較大的產品很好地區分開，這一結果也與SPME-GC-MS檢測結果基本一致。通過對SPME-GC-MS檢測技術可對樣品中揮發性呈香物質的具體種類和含量進行分析與比較，但不能確定這些物質作為一個整體時對樣品風味特征的貢獻度，而主成分聚類分析與之互補，得到的不是被測樣品中各揮發性呈香物質的定性或定量結果，而是樣品整體的風味信息，因此兩者配合有利于同時從宏觀和微觀上共同研究醬油樣品中的呈香物質。

3 結論

醬油的獨特風味是多種揮發性呈香物質共同作用的結果，中日兩類醬油中典型的呈香物質雖具有相似性，但又各自富有獨特風味。在兩種不同萃取條件下，日本醬油中的呈香物質以小分子醇類和酯類作為典型香氣成分，賦予日本醬油清淡爽口的風味特征，符合其作為蘸料佐料的產品定位。而中國醬油中以呈香吡嗪類、酯類和酮類化合物為主，賦予中國醬油綿長醇厚的獨特后味，適合其在高溫炒菜條件下展現出濃郁的醬香風味。通過本實驗，揭示了中日醬油在不同溫度處理條件下揮發性呈香物質的具體差異性，并結合主成分分析確定了不同模擬條件下兩種品牌醬油中貢獻最大的典型呈香物質，為區別中日兩種品牌醬油的風味特征提供數據參考，為中國民族醬油新產品的改進和革新提供科學的理論依據。