胃癌細(xì)胞中乳酸脫氫酶A表達(dá)變化及其對(duì)EMT的影響

陳妍，陳加華，李小琴

(1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212031；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院；3沭陽(yáng)仁慈醫(yī)院)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤[1]。資料顯示，2015年我國(guó)胃癌發(fā)病67.91萬(wàn)例，死亡49.8萬(wàn)例，發(fā)病率與病死率均居世界首位[2]。腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移是影響患者治療后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵，因此尋找胃癌特異性生物學(xué)指標(biāo)對(duì)治療胃癌及探究胃癌的侵襲與轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。研究顯示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在胃癌的侵襲與轉(zhuǎn)移中起核心作用[3]。乳酸脫氫酶A(LDH-A)是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，其高表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。蔡志煅等[5]報(bào)道，上調(diào)LDH-A表達(dá)能夠增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的糖酵解途徑，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖。LDH-A是否參與了胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，目前鮮有報(bào)道。2018年2～9月，我們觀察了胃癌細(xì)胞中LDH-A的表達(dá)變化，并采用siRNA技術(shù)沉默LDH-A表達(dá)，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞EMT的影響，旨在探討LDH-A在胃癌進(jìn)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人胃癌細(xì)胞株OCUM-1購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司，人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株RGM-1購(gòu)自上海基免生物科技有限公司。Lipfoctamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，siRNA無(wú)義對(duì)照序列、LDH-A siRNA由上海中洪博元生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并構(gòu)建，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Kit購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將OCUM-1細(xì)胞和RGM-1細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度接近90%時(shí)，進(jìn)行消化傳代。

1.3 細(xì)胞分組與干預(yù) 將OCUM-1細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和LDH-A siRNA組。空白對(duì)照組只加入培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染對(duì)照組轉(zhuǎn)染siRNA無(wú)義對(duì)照序列，LDH-A siRNA組轉(zhuǎn)染LDH-A siRNA序列。培養(yǎng)細(xì)胞至融合度約50%時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參照Lipfoctamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞中LDH-A mRNA檢測(cè) 采用qRT-PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA。采用SYBR Green PCR Kit對(duì)LDH-A進(jìn)行相對(duì)定量，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：90 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。所有樣品均重復(fù)測(cè)定3次。引物序列：LDH-A上游5′-GTCAGCAAGAGGGAGAAAGC-3′，下游5′-ATTCCACTCCATACAGGCACA-3′；內(nèi)參GAPDH上游5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-CAAAGCTCATGGATGACC-3′。采用2-ΔΔCt法對(duì)LDH-A水平進(jìn)行定量分析。

1.5 細(xì)胞中LDH-A蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS清洗，于冰上裂解離心后，吸取上清用于蛋白含量分析。采用Bio-Rad方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，然后進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，二抗室溫孵育1.5 h，TBST漂洗3次，每次分別漂洗10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。GIS凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以GAPDH作為內(nèi)參照，分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)測(cè)定3次。

1.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 收集各組細(xì)胞，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，拍照并保存。

1.7 EMT相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)、β連環(huán)蛋白(β-catenin)、波形蛋白(Vimentin),檢測(cè)步驟同“1.5”。

2 結(jié)果

2.1 OCUM-1細(xì)胞與RGM-1細(xì)胞中LDH-A mRNA及蛋白表達(dá)比較 OCUM-1細(xì)胞中LDH-A mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于RGM-1細(xì)胞(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組OCUM-1細(xì)胞LDH-A mRNA及蛋白表達(dá)比較 LDH-A siRNA組LDH-A mRNA及蛋白表達(dá)均低于空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 胃癌與正常胃黏膜細(xì)胞中LDH-A mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與RGM-1細(xì)胞比較，*P<0.05。

表2 各組OCUM-1細(xì)胞LDH-A mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.3 各組OCUM-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞排列松散，擴(kuò)散細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞間黏附明顯被破壞，部分細(xì)胞呈明顯梭形，表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞特性；LDH-A siRNA組細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞黏附性增加，逐漸表現(xiàn)為上皮細(xì)胞特性。見(jiàn)圖1。

注：圖中箭頭所指細(xì)胞呈明顯梭形。

圖1 各組OCUM-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較

2.4 各組OCUM-1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較 LDH-A siRNA組E-cadherin、Cytokeratin蛋白表達(dá)高于空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組，N-cadherin、Snail、β-catenin、Vimentin蛋白表達(dá)低于空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組OCUM-1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，#P<0.05。

3 討論

胃癌的發(fā)病率與病死率均較高，雖然近年來(lái)隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，胃癌的治療效果得到提升，但總體治療效果仍不盡人意。導(dǎo)致胃癌迅速進(jìn)展的主要原因是腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[6],因此尋找能夠抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的特異性腫瘤標(biāo)志分子，對(duì)于胃癌的靶向治療具有重要意義。

LDH-A屬于乳酸脫氫酶家族同工酶，其主要功能是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，是影響糖酵解的關(guān)鍵酶之一[7]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞的代謝特點(diǎn)是即使在有氧的條件下也能夠進(jìn)行糖酵解。研究表明，LDH-A在淋巴瘤等多種腫瘤組織中均表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平與腫瘤分化程度關(guān)系密切[8]。Zhai等[9]報(bào)道，抑制LDH-A表達(dá)能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，胃癌OCUM-1細(xì)胞LDH-A mRNA及蛋白表達(dá)均高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞，提示LDH-A在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可能作為促癌因子發(fā)揮作用。

EMT是指上皮樣細(xì)胞在病理與生理?xiàng)l件下向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，上皮細(xì)胞由原先長(zhǎng)方形、扁圓形或立方形等規(guī)則的上皮細(xì)胞，變?yōu)榧忓N形、梭形、星形等不規(guī)則的間質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞骨架發(fā)生改變，進(jìn)一步使上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞之間的連接性和黏附性降低，獲得較高的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移、抑制凋亡等能力[10]。本研究通過(guò)siRNA技術(shù)沉默胃癌細(xì)胞中的LDH-A表達(dá)，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，結(jié)果顯示空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組胃癌細(xì)胞排列松散，擴(kuò)散細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞間黏附明顯被破壞，部分細(xì)胞呈明顯梭形，表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞特性；LDH-A siRNA組胃癌細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞黏附性增加，逐漸表現(xiàn)為上皮細(xì)胞特性。提示LDH-A表達(dá)下調(diào)可促使胃癌細(xì)胞維持上皮樣細(xì)胞特性，抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，但其具體機(jī)制還不清楚。

EMT參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，除黏附性降低等形態(tài)特征改變外，還伴隨著上皮細(xì)胞特征蛋白E-cadherin、Cytokeratin和間質(zhì)細(xì)胞特征蛋白N-cadherin、Snail、β-catenin、Vimentin表達(dá)的改變[11]。E-cadherin蛋白參與同型細(xì)胞間的黏附連接，在維持細(xì)胞形態(tài)及極性中具有重要作用，是一種經(jīng)典的上皮細(xì)胞標(biāo)志物。Cytokeratin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的一類中間絲狀物，是另一種上皮細(xì)胞特征標(biāo)志物[12]。N-cadherin蛋白表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[13]。Snail是EMT相關(guān)標(biāo)志物，具有下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)的作用。β-catenin是鈣黏蛋白復(fù)合體的亞基，主要介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和參與基因表達(dá)[14]。Vimentin是細(xì)胞骨架蛋白中的一種，廣泛分布于各種內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞中，在維持間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架蛋白等蛋白間相互作用中發(fā)揮重要作用[15]。Scarpa等[16]研究結(jié)果表明，EMT伴隨E-cadherin蛋白向N-cadherin蛋白的轉(zhuǎn)化，鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換通過(guò)由細(xì)胞復(fù)極化產(chǎn)生更強(qiáng)的作用力，使細(xì)胞間連接分解。蘇醒等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Snail蛋白高表達(dá)和E-cadherin蛋白低表達(dá)與膽管癌的發(fā)生、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移(膽管結(jié)石上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化)有關(guān)。袁明等[18]研究表明，結(jié)腸癌細(xì)胞EMT過(guò)程中伴隨著β-catenin與N-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)和E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)。張燦燦等[19]報(bào)道，E-cadherin蛋白表達(dá)在上皮性卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，Vimentin及Snail蛋白表達(dá)上調(diào)，E-cadherin、Vimentin與Snail蛋白的表達(dá)調(diào)控與EMT過(guò)程有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LDH-A siRNA后，胃癌OCUM-1細(xì)胞中E-cadherin、Cytokeratin蛋白表達(dá)顯著升高，N-cadherin、Snail、β-catenin、Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低，表明LDH-A siRNA可使E-cadherin等上皮細(xì)胞特征蛋白表達(dá)上調(diào)，N-cadherin等間質(zhì)細(xì)胞特征蛋白表達(dá)下調(diào)，提示LDH-A siRNA可能抑制胃癌細(xì)胞EMT過(guò)程。

綜上所述，胃癌細(xì)胞中LDH-A表達(dá)升高；沉默LDH-A表達(dá)可上調(diào)胃癌細(xì)胞上皮細(xì)胞特征蛋白表達(dá)、下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞特征蛋白表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。本研究?jī)H探究了LDH-A在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)胃癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響，具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。