陜北小粒黑豆皮原花青素提取工藝及抗氧化性研究

高晶晶 慕 苗 閆君芝 劉麗娜

(榆林學院化學與化工學院，陜西 榆林 719000)

原花青素是由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素結合而成的聚合體[1]，具有較強的抗氧化及清除自由基能力[2]，在預防和治療心血管疾病、抗衰老、抗過敏、抗癌、抑菌等方面有顯著作用[3-6]。小粒黑豆是中國陜北地區(qū)種植的一種高產(chǎn)量黑豆品種，在黑豆產(chǎn)品加工過程中，豆皮大部分被去掉，豆皮的營養(yǎng)價值及其有效成分未被充分利用[7-8]。研究[9-11]表明，豆皮含有大量營養(yǎng)保健物質(zhì)，尤其是黑紫色種皮含有大量的抗氧化性物質(zhì)原花青素。目前，對黑豆皮的研究[12]主要集中在膳食纖維、色素、黃酮等方面，對黑豆皮原花青素的研究[13]鮮見報道，尤其是對其抗氧化性研究[14]則更少。

目前原花青素常用的提取方法有乙醇溶液提取法、超臨界提取法及雙水相萃取法等[15-16]。本研究擬采用乙醇溶液提取法，在單因素試驗基礎上，采用響應面法進行優(yōu)化，得到黑豆皮原花青素的最佳提取工藝，并對其抗氧化性進行研究，以期為原花青素的應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 原料和試劑

陜北小粒黑豆皮：陜西神木產(chǎn)；

無水乙醇：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；

甲醇、H2O2：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；

濃鹽酸：分析純，南京化學試劑股份有限公司；

鄰苯三酚、FeSO4、水楊酸：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

香草醛、VC(抗壞血酸)、DPPH：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

電子天平：FA-1004型，上海精科天平廠；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒科學儀器有限公司；

數(shù)顯超級恒溫水浴：HH-501型，鄭州科豐儀器設備有限公司；

分光光度計：UV-2450型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 兒茶素標準曲線繪制 采用兒茶素作為標準品進行檢測，準確配制濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL兒茶素標準溶液，空白液為蒸餾水，取空白和各濃度的標準液1 mL于6支試管中，分別加入5 mL 2%香草醛—甲醇溶液，最后各加入1 mL濃鹽酸震蕩搖勻，于500 nm測其吸光度值[17-18]，以兒茶素標準液的濃度及吸光度值為橫縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程y=1.089x+0.013 4，R2=0.998 4。

圖1 兒茶素標準曲線

1.2.2 黑豆皮原花青素含量的檢測 采用香草醛—鹽酸法。準確吸取原花青素提取液1 mL，稀釋一定倍數(shù)，后續(xù)操作與標準曲線制備相同。黑豆皮原花青素提取得率按式(1)計算。

(1)

式中：

R——黑豆皮花青素提取得率，%；

c——提取液中原花青素濃度，mg/mL；

v——原花青素提取液體積，mL；

m——黑豆皮質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗

(1) 提取液濃度對提取得率影響：準確稱取10 g黑豆皮粉末于三口燒瓶中，加入150 mL濃度分別為50%，55%，60%，65%，70%的乙醇溶液，45 ℃下水浴恒溫加熱，冷凝回流，攪拌，提取3.5 h，過濾，500 r/min離心10 min，測定上清液吸光度值，計算原花青素的提取得率。

(2) 提取時間對提取得率影響：準確稱取10 g黑豆皮粉末于三口燒瓶中，加入150 mL 60%乙醇溶液，45 ℃下水浴恒溫加熱，冷凝回流，攪拌，分別提取3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 h，后續(xù)方法同1.2.3(1)。

(3) 提取溫度對提取得率影響：準確稱取10 g黑豆皮粉末于三口燒瓶中，加入150 mL 60%乙醇溶液，分別于40，45，50，55，60 ℃下水浴恒溫加熱，冷凝回流，攪拌，提取4 h，后續(xù)方法同1.2.3(1)。

(4) 液料比對提取得率影響：準確稱取10 g黑豆皮粉末于三口燒瓶中，分別加入100，150，200，250，300 mL 60%乙醇溶液，50 ℃下水浴恒溫加熱，冷凝回流，攪拌，提取4 h，后續(xù)方法同1.2.3(1)。

1.2.4 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，以提取時間、提取溫度、液料比為試驗因素，以提取得率為評價指標，設計三因素三水平響應面試驗優(yōu)化原花青素提取工藝條件[19]。

1.2.5 黑豆皮中原花青素的抗氧化性測定

(1) DPPH自由基清除率：準確稱取一定量的DPPH溶解于無水乙醇配制成濃度為0.2 mmol/L的溶液，放置于棕色瓶中保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。取黑豆皮原花青素配制成濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL的溶液，取各濃度待測液2 mL分別加入2 mL DPPH乙醇溶液，搖勻，室溫避光下靜置30 min，517 nm下測定其吸光度值[20]。同時還需空白對照及同條件下Vc的DPPH自由基清除率的測定。DPPH自由基清除率按式(2)計算。

(2)

式中：

X——DPPH自由基清除率，%；

A0——原花青素液和DPPH混合液的吸光度值；

A1——原花青素液和空白溶劑(無水乙醇)混合液的吸光度值；

A2——DPPH溶液和空白溶劑混合液的吸光度值。

(2) 羥基自由基清除率：取5支試管分別加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4溶液和2 mL水楊酸溶液，搖勻后，分別加入2 mL濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的黑豆皮原花青素溶液，最后加入2 mL 0.3% H2O2溶液， 37 ℃下反應30 min，510 nm下測定吸光度值[21]。同時還需做空白對照及同條件下VC的羥基自由基清除率的測定。羥基自由基清除率按式(3)計算。

(3)

式中：

Y——羥基自由基清除率，%；

A0——空白液的吸光度值；

A1——原花青素液的吸光度值。

(3) 超氧陰離子清除率：取1 mL濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0. 5 mg/mL的黑豆皮原花青素溶液，依次加入pH 8.2，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液3 mL， 30 ℃水浴20 min，加入7 mmol/L鄰苯三酚3 mL混勻，反應4 min，加入1 mL濃鹽酸終止反應， 320 nm下測定吸光度值[22]。同時還需做空白對照及同條件下Vc的超氧陰離子清除率的測定。超氧陰離子清除率按式(4)計算。

(4)

式中：

Z——超氧陰離子清除率，%；

A0——原花青素液的吸光度值；

A1——以H2O代替鄰苯三酚的吸光度值；

A2——以H2O代替原花青素液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003對試驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計計算，單因素試驗采用Origin 8.0作圖，響應面優(yōu)化采用Design expert 10。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

由圖2(a)可知，在乙醇濃度為60%時，原花青素的提取效果較好，其他濃度不利于原花青素的溶出。由圖2(b)得出提取時間為4 h時提取得率最高，可能是由于超過4 h后，一部分原花青素分解，提取得率反而下降。由圖2(c)可知，提取溫度為50 ℃時提取得率最高，可能是其他溫度不利于原花青素的溶出，高溫可能導致一部分原花青素分解。由圖2(d)得出原花青素的提取得率隨液料比的增大而升高，當液料比超過20∶1(mL/g)時，增大溶劑用量并不能提高原花青素的提取得率。因此，選擇液料比為20∶1(mL/g)。綜上所述，在乙醇濃度60%、提取時間4 h、提取溫度50 ℃、液料比20∶1(mL/g)時，陜北小粒黑豆皮中原花青素的提取得率較高，可達5.25%。

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 試驗設計與結果分析 根據(jù)單因素試驗結果，以原花青素提取得率為響應值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理進行響應面設計，試驗因素水平見表1，試驗設計與結果見表2。

2.2.2 模型的建立及方差分析 由表3可知，回歸模型P<0.000 1，達到高度顯著水平，失擬誤差項P>0.05，不顯著，說明該模型誤差小，擬合度好；可預測黑豆皮原花青素的提取過程及提取結果。 BC、AC項的P值<0.000 1，說明溫度和液料比、時間和液料比的交互作用對提取得率的影響最大，為主要限制因素；從一次項的P值可知，液料比對提取得率的影響最大，其次是提取溫度和提取時間。通過響應面軟件的分析和計算，得回歸方程：

圖2 提取條件對黑豆皮中原花青素提取得率的影響

表1 響應面因素與水平設計表

Y=5.32+0.099A+0.14B-0.15C-0.097AB-0.32AC-0.033BC-0.51A2-0.85B2-0.73C2。

(5)

2.2.3 響應面分析 由圖3可知，提取溫度大于提取時間的影響，液料比明顯大于提取時間的影響，液料比大于提取溫度的影響，與2.2.2中P值比較得出液料比>提取溫度>提取時間一致。

由響應面法建立的提取模型及回歸方程預測的最優(yōu)提取工藝條件為提取時間4.16 h、提取溫度52.77 ℃、液料比22∶1(mL/g)，預測提取得率5.463%。為便于操作，將提取條件修正為提取時間4.2 h、提取溫度53 ℃、液料比22∶1(mL/g)，進行3次試驗驗證，得到黑豆皮原花青素平均提取得率為5.380%，與預測值5.463%基本接近，說明該提取模型預測優(yōu)化黑豆皮原花青素提取工藝是準確可行的。

表2 響應面試驗方案與提取得率

2.3 原花青素抗氧化性試驗

2.3.1 DPPH自由基清除率 從圖4可以看出，隨著原花青素和VC濃度的增加，DPPH自由基清除率逐漸增加。同濃度下，VC對DPPH自由基清除率均略高于原花青素。濃度均為0.10 mg/mL時，原花青素的清除率為68.5%，而VC的清除率可達73.8%。黑豆皮原花青素的IC50值為0.075 mg/mL。結果表明：黑豆皮原花青素對DPPH自由基清除率與VC基本接近，且在一定的范圍內(nèi)其濃度與DPPH自由基清除率存在一定的量效關系。

表3 提取模型的顯著性檢驗及分析表?

? P<0.000 1差異高度顯著；P<0.05差異顯著；P>0.05差異不顯著。

圖3 兩因子交互作用對提取率的響應面圖

圖4 原花青素對DPPH自由基的清除作用

2.3.2 羥基自由基清除率 從圖5可以看出，隨著原花青素和VC濃度的增加，羥基自由基清除率逐漸增加，但增加速率逐漸變緩。同濃度下，VC對羥基自由基清除率略高于原花青素。濃度為1.0 mg/mL時，原花青素的清除率為68.7%，VC的清除率為74.3%。黑豆皮原花青素的IC50值為0.590 mg/mL。結果表明：黑豆皮原花青素對羥基自由基清除率與VC基本接近，有較好的羥基自由基清除能力。

圖5 原花青素對羥基自由基的清除作用

2.3.3 超氧陰離子清除率 從圖6可以看出，隨著原花青素和VC濃度的增加，超氧陰離子清除率增加。VC的清除率大于原花青素的。濃度為0.5 mg/mL時，原花青素清除率為77.6%，VC清除率為82.5%。黑豆皮原花青素的IC50值為0.220 mg/mL。

圖6 原花青素對超氧陰離子的清除作用

3 結論

本試驗對陜北小粒黑豆皮原花青素提取進行了研究，在單因素試驗基礎上采用響應面法優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為提取時間4.2 h、提取溫度53 ℃、料液比22∶1(mL/g)、乙醇濃度60%，在此條件下陜北小粒黑豆皮原花青素平均提取得率為5.380%。黑豆皮原花青素的抗氧化性試驗研究表明原花青素對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子均具有一定的清除效果，該抗氧化能力與原花青素濃度有一定的關系，其IC50值分別為0.075，0.590，0.220 mg/mL。通過本試驗說明陜北小粒黑豆皮原花青素含量可觀且具有較好的抗氧化活性，后續(xù)可對黑豆皮中原花青素的抗氧化有效成分作進一步研究。