秀珍菇鮮味菇液酶解制備工藝優化

方若思 吳安琰 顧宇婷 陳咨豪 李 堅 項雅麗 楚秉泉 肖功年 劉士旺 龔金炎

(1. 浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省農產品化學與生物加工技術重點試驗室，浙江 杭州 310023；3. 浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，浙江 杭州 310023)

食用菌含有豐富的氨基酸等呈味物質，鮮味獨特，因此調味料開發是其深加工的重要方向。國內外采用食用菌提取物提味增鮮，但工藝簡單，食用菌來源單一[1]。秀珍菇脂肪含量較低，蛋白質含量豐富，氨基酸種類齊全，其中必需氨基酸含量在35%以上[2-3]，還含有活性多糖、黃酮等成分[4-6]。但關于酶解法提取秀珍菇有效成分的工藝研究較少，陳雅平等[7]以氨基酸利用率為主要評價指標酶解秀珍菇，通過單因素試驗和正交試驗，最佳酶解條件為復合風味酶用量0.5%，酶解時間120 min，酶解溫度50 ℃，pH值8.5，秀珍菇氨基酸利用率為27.9%；李佳佳等[8]以秀珍菇干粉為原料，利用生物酶解和美拉德反應技術制備具有菌菇特征風味的調味核心基料，以還原糖含量和揮發性風味物質為指標，確定纖維素酶和中性蛋白酶的最佳酶解條件，在此條件下制備的秀珍菇酶解液水解度為13.75%。利用秀珍菇與其他菌類復配的食用菌調味菇液的研究則未見報道，國外研究主要集中在秀珍菇的主要功能及相關生物活性、營養成分的鑒定分離純化及開發等方面[8-9]；而國內研究則主要集中在生物學特性、褐變保鮮、功能成分提取及活性等方面[10-11]。

海鮮菇是一種藥食兩用的珍稀菌[12-13]，氨基酸含量豐富，含有對人體有益的黃酮和酚類等營養成分，具有抗炎癥、抗氧化等功能[14-16]。香菇營養豐富，含有如多糖、香菇嘌呤、氨基酸等多種有效成分，香菇多糖的抗病毒，抗腫瘤以及調節免疫功能突出[17]。灰樹花味道鮮美，營養豐富，抗腫瘤多糖、多酚、酮類和甾類的含量可觀，具有抗腫瘤、免疫調節、平衡營養成分等特殊藥理作用[18-19]。

為均衡營養、提高活性成分含量，協調不同食用菌的功能，本試驗擬以秀珍菇為主要原料，輔以海鮮菇、香菇和灰樹花3種食用菌，探索不同配比的食用菌在纖維素酶和蛋白酶復配的酶解條件下，優化制取高氨基酸含量的食用菌調味菇液的工藝條件，以期為秀珍菇等食用菌綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

秀珍菇、海鮮菇、香菇、灰樹花：縉云縣珍稀食用菌專業合作社提供；

秀珍菇、海鮮菇、香菇、灰樹花在50～70 ℃下烘干8 h、磨成粉末，裝在封口袋中放置于陰涼干燥處保存。

1.1.2 試劑

抗壞血酸：生物試劑，純度>98%，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；

茚三酮：生物試劑，純度>98%，國藥集團化學試劑有限公司；

醋酸、正丙醇、正丁醇、乙二醇：分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；

硫酸：分析純，衢州巨化試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高速離心機：TG18K型，長沙東旺實驗儀器有限公司；

高速多功能粉碎機：RHP-600型，浙江榮浩工貿有限公司；

凱氏定氮儀：UDK 159型，上海人和科學儀器有限公司；

電熱鼓風干燥箱：GZX-9076 MBE型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；

紫外可見分光光度計：UV 5500PC型，上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

各食用菌按比例混合→加水溶解→調節pH→纖維素酶酶解4 h→調節pH→蛋白酶酶解→滅酶→離心→鮮味菇液

1.3.2 食用菌蛋白質含量測定 凱氏定氮法。參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》，采用VELP UDK159自動定氮儀測定。

1.3.3 酶解工藝的優化

(1) 食用菌配伍比例：取3.333 g(料液比1∶15 g/mL)不同食用菌配伍比(見表1)食用菌干粉，加入50 mL去離子水充分溶解，調節pH至5.0，加入0.04%纖維素酶，搖勻，于50 ℃水浴酶解4 h，調節pH至7.0，加入0.1% 蛋白酶，搖勻，再置于50 ℃水浴酶解5 h。酶解結束后，水解液在100 ℃下加熱滅酶10 min，7 000 r/min離心15 min，取適量上清液20倍稀釋后備用。

表1 食用菌配伍質量比例

(2) 料液比：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，以料液比1∶10，1∶15，1∶20,1∶25 (g/mL)，按1.3.2(1)所示方法，考察料液比對水解度的影響。

(3) 蛋白酶酶解溫度：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，按1.3.2(1)所示方法，加入蛋白酶搖勻后，分別于30，35，40，45，50，55 ℃ 的水浴酶解5 h，考察蛋白酶酶解溫度對水解度的影響。

(4) 蛋白酶酶解時間：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，按1.3.2(1)所示方法，加入蛋白酶搖勻后，分別于50 ℃水浴酶解0.5，1.0，3.0，5.0，7.0 h，考察蛋白酶酶解時間對水解度的影響。

(5) 纖維素酶酶解pH值：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，分別調節纖維素酶酶解pH至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，按1.3.2(1)所示方法，考察纖維素酶酶解pH值對水解度的影響。

(6) 蛋白酶酶解pH值：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，加入50 mL去離子水充分溶解，調節pH至5.0，加入0.021 3 g 纖維素酶，搖勻，于50 ℃水浴酶解4 h，分別調解pH至6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，加入0.053 3 g蛋白酶，搖勻，于50 ℃水浴酶解5 h。隨后加熱滅酶并離心，取適量上清液20倍稀釋后備用。

(7) 纖維素酶添加量：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，按1.3.2(1)所示方法，分別加入0.02%，0.04%，0.10%，0.20%，0.40% 纖維素酶，考察纖維素酶添加量對水解度的影響。

(8) 蛋白酶添加量：取秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花質量比為5∶3∶1∶1的食用菌干粉，按1.3.2(1)所示方法，分別加入0.02%，0.04%，0.10%，0.20%，0.40% 蛋白酶，搖勻，考察蛋白酶添加量對水解度的影響。

1.3.4 測定項目及方法

(1) 游離α-氨基態氮測定：取待測液1.0 mL，去離子水1mL，水合茚三酮3.0 mL(0.6 g重結晶的茚三酮用15 mL 正丙醇、30 mL正丁醇、60 mL乙二醇及9 mL pH 4.54的醋酸鹽緩沖液溶解)，0.1%抗壞血酸溶液0.1 mL，混勻，封口。沸水浴加熱15 min后冷卻，加入14.9 mL的60%乙醇溶液，搖勻，于570 nm測定吸光度。

標準曲線的繪制：分別取5 μg/mL精氨酸氨基酸標準溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL至6個25 mL容量瓶中，分別加水補充至2.0 mL，加水合茚三酮3.0 mL，加抗壞血酸溶液0.1 mL(質量分數0.1%)，混勻，封口，在沸水浴中加熱15 min，取出用冷水快速冷卻至室溫，定容，搖勻，靜置15 min，加入14.9 mL的60%乙醇溶液，搖勻，于570 nm波長下，以空白試劑為參比測定各溶液吸光度A，以氨基酸質量濃度為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。

(2) 水解度的測定：水解度指游離α-氨基態氮占總氮的百分比，按式(1)計算：

(1)

式中：

c——水解度，%；

m1——游離α-氨基態氮質量，g；

m2——總氮質量，g。

2 結果與分析

2.1 食用菌蛋白質含量測定

由表2可知：秀珍菇蛋白質含量(19.958 g/100 g)最高，其次為灰樹花(蛋白質含量約14.128 g/100 g)，再次為海鮮菇(蛋白質含量為12.852 g/100 g)，香菇蛋白質含量最低(12.719 g/100 g)。因此，選擇以秀珍菇為主要原料，配合香菇、海鮮菇和灰樹花的食用菌干粉為研究對象。

2.2 游離α-氨基氮標準曲線的繪制

以精氨酸標準液質量為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制得到的標準曲線，回歸方程為y=0.037 3x-0.009 3，相關系數為R2=0.989 9，結果如圖1所示。

表2 各菌菇的含氮量及蛋白質含量(干基)

圖1 α-氨基氮標準曲線

2.2 單因素最佳酶解條件確定

2.2.1 食用菌配伍比例對水解度的影響 蛋白質含量高的菌菇，其組分含量越高，水解度就越大，秀珍菇的蛋白質含量最大。由圖2可以看出：隨著秀珍菇組分含量的升高，水解度增大，秀珍菇∶香菇∶海鮮菇∶灰樹花=6.0∶3.0∶0.5∶0.5時，水解度達到最大值為16.987%，此時氨基酸占總氮含量的比重最大，說明在該條件下，酶解產生的游離氨基酸含量最高。因此，確定該配比為最佳配比。

圖2 組分比對水解度的影響

2.2.2 料液比對水解度的影響 由圖3可知：當料液比為1∶15(g/mL)時，水解度達到最大值為16.463%，此時氨基酸占總氮含量的比重最大，說明在該條件下，酶解產生的游離氨基酸含量最高。因此，確定該料液比為最佳。

2.2.3 蛋白酶酶解溫度對水解度的影響 蛋白酶酶解溫度是影響蛋白酶活性的重要因素。如圖4所示，在30～40 ℃時水解度隨著溫度的升高而大幅增大，溫度達到40 ℃ 時樣品蛋白質的水解度達到最大值17.939%，當溫度從40 ℃繼續上升到60 ℃時水解度逐漸下降，酶解溫度對水解度的影響較大。因此，選定40 ℃為蛋白酶酶解的最適溫度，進入下一步試驗。

圖3 料液比對水解度的影響

圖4 蛋白酶酶解溫度對水解度的影響

2.2.4 蛋白酶酶解時間對水解度的影響 由圖5可知，酶解0.5～5.0 h時，隨時間的延長，水解度逐漸增大，且在3～5 h時增幅最大，酶解5 h后增幅減緩。故后續試驗選擇蛋白酶酶解時間為5 h。

2.2.5 纖維素酶酶解pH值對水解度的影響 pH值可影響底物和纖維素酶的穩定性。由圖6可知：隨著pH的增大，水解度逐漸增大，當pH達到5.5時水解度達到最大值17.470%，之后水解度呈現明顯的下降趨勢。因此，選擇纖維素酶酶解pH為5.5為最佳。

圖5 蛋白酶酶解時間對水解度的影響

圖6 纖維素酶酶解pH值對水解度的影響

2.2.6 蛋白酶酶解pH值對水解度的影響 由圖7可知，隨著pH的增大，水解度逐漸增大，當pH達到7.5時水解度達到最大值，之后水解度呈現明顯的下降趨勢。因此，后續試驗選擇蛋白酶酶解pH為7.5。

圖7 蛋白酶酶解pH值對水解度的影響

2.2.7 纖維素酶添加量對水解度的影響 如圖8所示，當底物含量較高時，酶促反應速度與酶含量呈正比，纖維素酶添加量在0.02%～0.10%時，水解度大幅增加，而在0.10%～0.40%時水解度有減小的趨勢，原因有兩個：① 當酶添加量達到0.1%以后，水解產生的產物可能對酶活有抑制作用；② 大部分底物已被反應消耗。所以最適纖維素酶添加量為0.10%。

圖8 纖維素酶添加量對水解度的影響

2.2.8 蛋白酶添加量對水解度的影響 從圖9可以看出：當蛋白酶添加量從0.02%增加到0.10%時，酶促反應速率大大增加，水解度大幅增加。當蛋白酶添加量從0.10% 增加到0.40%時，雖然酶促反應速率繼續增大，但底物物料有限，幾乎被完全水解，所以水解度趨于平穩。因此，選擇0.10%為最適蛋白酶添加量。

圖9 蛋白酶添加量對水解度的影響

2.3 響應面法優化最佳酶解工藝

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗 在單因素試驗的基礎上，選取對水解度影響較大的蛋白酶酶解溫度、纖維素酶添加量和蛋白酶酶解pH值等3個影響因子，其他因素選取單因素試驗最佳條件，采用三因素三水平的響應曲面分析方法進行酶解條件的優化，其因素水平編碼見表3，試驗因素與水平設計見表4。軟件分析得到水解度對以上3個因素的二次多項回歸模型為：

DH=-437.710 18+5.471 63A+31.909 13B+93.122 27C+0.959 53AB-0.044 06AC+5.580 96BC-0.062 499A2-505.540 58B2-6.298 88C2。

(2)

2.3.2 響應曲面分析與優化 由圖9可以看出，隨著纖維素酶量從0.05%增加到0.11%和蛋白酶酶解溫度從35 ℃ 上升到42 ℃的過程中，水解度上升變化明顯；繼續提高纖維素酶添加量和蛋白酶酶解溫度，水解度開始下降。結合等高線圖可以得出，等高線中的最小橢圓的中心點即是響應面的最高點，等高線形狀呈橢圓形，表示A和B兩因素交互作用較顯著。由圖10可以得出，蛋白酶酶解溫度和蛋白酶pH值曲線坡度大，說明這兩個因素對水解度的影響變化很快。隨著蛋白酶酶解溫度從35 ℃上升到42 ℃和蛋白酶pH值從7.0上升到7.4的過程中，水解度上升變化明顯；繼續提高蛋白酶酶解溫度，水解度上升變化不明顯；而繼續提高蛋白酶pH值，水解度急劇下降，表明蛋白酶對pH變化較敏感且其最適宜pH為7.2～7.4。結合等高線圖可以得出，等高線中的最小橢圓的中心點即是響應面的最高點，等高線形狀呈橢圓形，表示A和C兩因素交互作用較顯著。由圖11以發現，蛋白酶pH值曲線比纖維素酶添加量曲線變化更大，說明蛋白酶pH值對水解度的影響更為顯著。隨著纖維素酶添加量從0.05% 上升到0.11%和蛋白酶pH值從7.0上升到7.4的過程中，水解度平穩上升；繼續提高纖維素酶添加量和蛋白酶pH值，水解度呈現下降趨勢。結合等高線圖可以發現，等高線圖形呈明顯的橢圓形，表明B和C兩因素交互作用顯著。

表3 因素水平編碼表

表4纖維素酶和蛋白酶酶解條件的響應面優化方案與結果

Table4Responsesurfaceoptimizationschemeandresultsofcellulaseandneutralproteasehydrolysisconditions

組別ABCDH/%100018.416200017.802300018.357410-117.6825-1-1014.382601114.745710115.3918-11014.56890-1-116.262100-1112.9231101-117.5251211016.85013-10112.6691400018.5341500017.90216-10-114.519171-1015.704

表5 響應曲面二次回歸方程模型方差分析結果?

圖10 蛋白酶酶解溫度和纖維素酶添加量對水解度的影響

圖11 蛋白酶酶解溫度和酶解pH值對水解度的影響

圖12 纖維素酶添加量和蛋白酶酶解pH值對水解度的影響

結合P值可知：模型的一次項A和C極顯著，二次項A2和C2極顯著，B2顯著表明各因素對水解度的影響不是簡單的線性關系。該模型下得到最佳工藝參數為蛋白酶酶解溫度42.06 ℃、蛋白酶pH 7.29、纖維素酶添加量0.11%，此時水解度為18.775%。結合實際，調整各因素為蛋白酶酶解溫度42 ℃、蛋白酶pH 7.30、纖維素酶添加量0.10%，此時水解度為18.510%，與預測值相差為1.41%，證明了該模型的可靠性。

3 結論

本試驗結果表明，制取高氨基酸含量的最優酶解工藝條件為蛋白酶酶解溫度42 ℃、蛋白酶pH 7.30、纖維素酶添加量0.10%，此時水解度為18.510%。

多種食用菌復配結合制備鮮菇菌液的方式，不僅有利于協調不同食用菌的氨基酸，同時可以增加產品的功能性，為開發秀珍菇等食用菌深加工產品提供新思路，但是本研究還存在一些不足，雖然水解度比單一采用秀珍菇水解度高[19]，但仍有提高空間，這可能與所選取的食用菌種類有關，后續可以本研究作為基礎，開發更多秀珍菇及其他菌類復合的深加工產品，提高氨基酸利用率，增進營養和保健功能。同時，進行單一菌菇酶解制備菇液，得到鮮味液體在氣味上尚有不足；如果通過添加部分還原糖，進行美拉德反應，就能夠滿足氣味上的要求。