鐵莧菜不同極性萃取物的抗氧化及抑菌活性研究

尹顯樓 詹濟華 譚 洋 裴 剛 李 玲

(1. 湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2. 衡陽市中心醫院藥劑科，湖南 衡陽 421001)

鐵莧菜別名海蚌含珠，為大戟科鐵莧菜屬草本植物，廣布于中國南方各地區，其嫩葉可以食用，為當地民間野菜品種之一[1]。據報道，鐵莧菜主要化學成分有萜類、酚酸、黃酮和生物堿類[2]，具有清熱解毒、止痢、止血之功效[3]，其中萜類、甾醇類活性成分[4]主要集中于石油醚萃取物，酚酸、黃酮類活性成分[5-6]主要存在于氯仿和乙酸乙酯萃取物，極性較大的正丁萃取物具有較多糖苷類活性成分。目前對鐵莧菜的研究[7-9]主要集中在其多糖和總黃酮的抗氧化以及總黃酮抑菌活性方面，對鐵莧菜酚酸類活性成分系統分離研究比較缺乏。如王春景等[10]試驗僅考察鐵莧菜中甲醇、70%乙醇等極性較大溶劑提取物的抗氧化和抑菌效果，并未對其中具體的抗氧化和抑菌主要活性成分進行進一步系統分離。

本試驗擬以鐵莧菜為原料，采取乙醇回流提取、系統梯度萃取法得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相5個不同極性萃取物，測定鐵莧菜各萃取物的總酚酸含量，分析鐵莧菜不同極性萃取物清除DPPH自由基和NO自由基的能力與抑制β-胡蘿卜素漂白能力及抑菌活性，為鐵莧菜在食品天然抗氧化劑和抑菌劑方面的研究開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鐵莧菜：采于湖南臨武縣，無病蟲害；

VC：美國Sigma公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、β-胡蘿卜素：上海梯希愛化成工業發展公司；

Gries試劑(0.1%α-萘胺和2%磷酸的水溶液、1%對氨基苯酸)：天津市光復經濟化工研究所；

亞油酸、吐溫-80、硝普鈉：國藥集團化學制劑有限公司；

磷鉬鎢酸試液：廈門海標科技有限公司；

乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇：分析純，恒興化學試劑制造有限公司。

1.1.2 試驗菌種

大腸桿菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：湖南中醫藥大學醫學基礎微生物與免疫學教學中心提供。

1.1.3 主要儀器

電子分析天平：ES-320型，美國德安特公司；

真空干燥箱：DZF-6050AB型，北京中興偉業儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：N-1300型，上海愛朗儀器有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1F型，鄭州宏朗儀器設備有限公司；

酶標儀：DNM-9602型，北京普朗新技術有限公司；

生化培養箱：SHH-150L型，重慶四達儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV1800PC型，上海奧析科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鐵莧菜不同極性萃取物的制備 稱取干燥的鐵莧菜地上部分10 kg，粉碎后過40目篩，用70%乙醇回流提取3次，每次2 h，過濾合并濾液，于60 ℃減壓旋轉蒸發溶劑，得到鐵莧菜固體浸膏415.40 g，用水攪散搖勻，先用石油醚萃取除去色素、油脂等弱極性物質，再用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等溶劑按體積1∶2的比例來依次萃取，減壓蒸發溶劑干燥，依次得到石油醚相73.00 g、氯仿相6.20 g、乙酸乙酯相9.20 g、正丁醇相57.25 g和水相148.60 g，各相浸膏置于4 ℃冰箱冷藏備用。按式(1)計算各不同萃取物浸膏的提取率，每個部位結果平行測定3次，取平均值。

(1)

式中：

T——各部位浸膏的提取率，%;

Wm——各部位浸膏的重量，g;

Wn——乙醇提取物的重量，為415.40 g。

1.2.2 總酚酸含量測定 采用Folin-Ciocalteu法[11-13]。

(1) 標準曲線的繪制：精密移取0，0.10，0.20，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 mL的沒食子酸對照品溶液(0.1 mg/mL)，分別置于25 mL容量瓶中，精密加入0.50 mL 磷鉬鎢酸試液，再精密加入14.00，13.90，13.80，13.70，13.40，13.10，12.80，12.50 mL蒸餾水，搖勻，再用27%碳酸鈉溶液定容至刻度線，搖勻，避光放置60 min，以相應空白試劑做空白，在760 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線(曲線方程：Y=0.128X+0.116 1，R2=0.997 1)，如圖1所示。結果表明在0.4～6.0 μg/mL的范圍內具有良好的線性關系，該方程可用于鐵莧菜中總酚酸含量的測定?？偡铀岷坑妹靠溯腿∥镏泻械臎]食子酸毫克數表示。

(2) 樣品總酚酸含量的測定：將樣品溶液稀釋一定的倍數，按照1.2.2(1)顯色，得到吸光度值，并代入標準曲線方程計算總酚酸含量。

1.2.3 供試液的制備 精密稱取鐵莧菜石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取物和VC各20 mg，先用70%乙醇溶液將各樣品定容至2.0 mg/mL，再用二倍稀釋法配成濃度為2.000 0，1.000 0，0.500 0，0.250 0，0.125 0，0.062 5 mg/mL的供試液，再用70%乙醇溶液配置成0.004%的DPPH儲備液，避光保存備用。

圖1 鐵莧菜總酚酸標準曲線圖

1.2.4 清除DPPH自由基法 參考文獻[14]修改如下：將50 μL供試液及250 μL DPPH儲備液加入到同一微孔中，搖勻，室溫避光反應30 min，用酶標儀于517 nm處測定吸光度C1，同時測定250 μL DPPH儲備液與50 μL 70%乙醇溶液混合后的吸光度C0，以及50 μL供試液與250 μL 70%乙醇溶液混合后的吸光度C2，以VC溶液作陽性對照，按式(2)計算清除率。

(2)

式中：

I——DPPH自由基清除率，%；

C1——供試品組吸光度值；

C2——空白組吸光度值；

C0——對照組吸光度值。

1.2.5β-胡蘿卜素漂白法 根據文獻[15]，精密稱取4.0 mgβ-胡蘿卜素、40.0 mg亞油酸和400.0 mg Tween-80，混合后用5.0 mL氯仿溶解，于50 ℃減壓旋轉蒸干氯仿，再添加200 mL蒸餾水超聲即得乳液。分別取上述30 μL 供試液，對照組加入300 μL乳液，空白組中300 μL乳液不添加β-胡蘿卜素，以VC作陽性對照，50 ℃水浴反應60 min后，用酶標儀測定樣品在490 nm下0 min時和60 min時的吸光度值。按式(3)計算抑制率。

(3)

式中：

M——β-胡蘿卜素抑制率，%；

A60(對)——60 min時對照組吸光度值；

A60(空)——60 min時空白組吸光度值；

A0(對)——0 min時對照組吸光度值；

A0(空)——0 min時空白組吸光度值。

1.2.6 清除NO自由基法 根據文獻[15],分別取上述的80 μL硝普鈉溶液，供試品組加入120 μL供試液，空白組以不加供試液作空白，29 ℃光照3 h，加Gries試劑50 μL，反應0.5 h，用酶標儀測定樣品在490 nm下的吸光度值，以VC為陽性對照，每組試驗重復3次，取平均值。按式(4)計算清除率。

(4)

式中：

N——NO自由基清除率，%；

A1——供試品組吸光度值；

A2——空白組吸光度值。

1.2.7 體外抑菌試驗

(1) 菌株的活化和制備：將表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、藤黃微球菌等7種菌株接種在10 mL營養肉湯中進行活化(布氏肉湯中接種幽門螺桿菌)，于培養箱中37 ℃ 恒溫培養24 h，幽門螺桿菌在微需氧條件下培養24 h[16]。菌落長出后，在超凈工作臺內挑取適量活化后的細菌接種于肉湯中，振蕩混勻，幽門螺桿菌用布氏肉湯進行稀釋，其他6種菌株則以營養肉湯稀釋，調整細菌濃度為108CFU/mL，制備得到細菌懸液。

(2) 最小抑菌濃度(MIC)的測定：參考文獻[17]修改如下：試驗設空白組、樣品組和陽性對照組，指示菌為幽門螺桿菌樣品組，以阿莫西林和甲硝唑為陽性對照，其他6種菌株均以阿莫西林和頭孢拉定為陽性對照藥?？瞻捉M加入100 μL液體培養基。樣品組每孔加入100 μL細菌懸液和適量的各萃取物濃度為100 mg/mL的供試液，陽性對照組加入濃度均為20 mg/mL阿莫西林、頭孢拉定和甲硝唑，以2倍稀釋法對各孔進行逐步稀釋，每個濃度平行3個復孔，使得樣品終濃度為10.000 0，5.000 0，2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.312 5 mg/mL。陽性對照組終濃度為2.000 0，1.000 0，0.500 0，0.250 0，0.125 0，0.062 5 mg/mL。加樣完成后，用酶標儀測定在450 nm下的光密度值(OD)。然后將微孔板放置在溫度37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。幽門螺桿菌的微孔板和蠟燭缸一同放入培養箱中培養48 h，之后用酶標儀測定在450 nm下的OD值，按式(5)計算供試藥抑菌OD值。

(5)

式中：

C——供試藥的抑菌率，%；

m2——培養后加藥OD值；

m1——培養后空白OD值；

n2——培養前加藥OD值；

n1——培養前空白OD值。

供試藥抑菌OD值越大，表明該藥物抑菌效果越小。以空白孔為對照，并結合倒置顯微鏡觀察，以不發生混濁變化，且供試藥OD值不高于空白孔的OD值的最高藥物稀釋倍數為該藥物的MIC值。

2 結果與分析

2.1 醇提物及其不同極性萃取物得率、總酚酸含量

如表1所示，由于溶劑的極性不同對萃取物的得率、成分均有較大的影響，其中石油醚相、正丁醇相、水相的提取率較高(分別為17.57%，13.78%，35.77%)?？偡铀岷繌男〉酱笈判驗槭兔严?氯仿相<水相<正丁醇相<乙醇提取物<乙酸乙酯相，其中乙酸乙酯萃取物的總酚酸含量高達232.36 mg/g。

表1 不同極性萃取物的提取率和總酚酸含量

2.2 體外抗氧化試驗

2.2.1 清除DPPH自由基能力 由圖2可知，鐵莧菜不同極性萃取物對DPPH自由基均具有較好的清除效果；在0.05～2.0 mg/mL時，各萃取物的清除率呈劑量依賴性。在濃度為2.0 mg/mL，其清除率為正丁醇部位(94.60%)>乙酸乙酯部位(87.92%)>氯仿部位(74.15%)>石油醚部位(48.47%)，而陽性對照藥VC的清除率為(95.08%)，表明正丁醇萃取物的抗氧化效果最好，并且抗氧化能力與VC相當。

圖2 鐵莧菜不同極性萃取物和VC的DPPH

Figure 2 DPPH radical scavenging rate of of different polar extracts fromAcalyphaaustralisL. and VC

2.2.2 抑制β-胡蘿卜素漂白反應 由圖3可知，鐵莧菜不同極性萃取物均具有較好的抑制β-胡蘿卜素漂白的效果；在0.05～2.0 mg/mL時，隨著濃度上升，鐵莧菜各萃取物對β-胡蘿卜素氧化逐漸増強。當濃度達到2.0 mg/mL時，對β-胡蘿卜素氧化抑制率為正丁醇部位(83.15%)>氯仿部位(78.36%)>乙酸乙酯部位(68.94%)>石油醚部位(68.74%)，均比陽性對照藥VC(44.51%)的抑制率高，其中正丁醇部位抑制β-胡蘿卜素漂白的效果最好。表明在一定的濃度范圍內，鐵莧菜各萃取物具有較好的抑制β-胡蘿卜素漂白反應的效果。

2.2.3 清除NO自由基能力 據圖4可知，在0.05～2.0 mg/mL 時，鐵莧菜不同極性萃取物對NO自由基的清除率與濃度呈正相關；當濃度達到2.0 mg/mL時，不同極性萃取物對NO自由基清除率為乙酸乙酯部位(82.72%)>石油醚部位(82.49%)>正丁醇部位(81.49%)>氯仿部位(79.18%)，均弱于陽性對照藥VC(92.00%)，各萃取物清除NO自由基能力相當。結果表明在一定的濃度范圍內，鐵莧菜各萃取物均具有較好的清除NO自由基能力。

圖3 鐵莧菜不同極性萃取物和VC的β-胡蘿卜素漂白抑制率

Figure 3 Inhibition ofβ-carotene oxidation by different polar extracts fromAcalyphaaustralisL. and VC

圖4 鐵莧菜不同極性萃取物和VC的NO自由基清除率

Figure 4 Nitric oxide radical scavenging rate of different polar extracts fromAcalyphaaustralisL. and VC

2.3 體外抑菌試驗

由表2可知，鐵莧菜各萃取部位對所選7種細菌均具有不同程度的抑制效果，并且對不同細菌的MIC值也不同，其中對革蘭氏陽性菌抑菌效果比革蘭氏陰性菌效果要好。石油醚部位、氯仿部位和正丁醇部位對枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌抑菌效果較強。特別是石油醚部位對大腸桿菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌抑制作用最佳，MIC值分別為0.625 0，0.312 5，1.250 0 mg/mL，可以通過柱層析硅膠、凝膠等方法來進一步分離純化石油醚萃取部位，篩選出明確有效的抑菌活性成分。

3 結論

經上述試驗可知，鐵莧菜乙醇提取物及各萃取物都含有總酚酸，各萃取物均具有較強的清除DPPH、NO自由基能力和抑制β-胡蘿卜素漂白的能力。正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物抗氧化效果較為顯著，可能與其較高的總酚酸含量有關[18-19]，表明各萃取物中總酚酸含量與抗氧化能力呈正相關。體外抑菌活性篩選顯示，鐵莧菜各萃取物均有較好的抑菌活性，尤其是石油醚部位對大腸桿菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果最為顯著。經查閱文獻[20]發現，鐵莧菜石油醚萃取物含有大量的三萜類和甾體類化學成分，可能是其抑菌有效活性成分。本試驗系統地研究了鐵莧菜不同極性萃取物的抗氧化和抑菌活性，對鐵莧菜主要活性成分進行進一步富集，并對各萃取物的抗氧化和抑菌活性系列數據進行了補充，為后續能夠通過柱層析等方法靶向分離抗氧化和抑菌活性化合物做前期準備。下一步將對鐵莧菜乙酸乙酯萃取物和石油醚萃取物做更深入的分離純化，以得到明確的抗氧化和抑菌活性化合物。

表2 鐵莧菜不同極性萃取物MIC?

? “-”表示未進行試驗。