馬鈴薯Y病毒兩個黑龍江煙草分離物的全基因組序列分析

姜瀚林，程林發，姜鵬超，郭兆奎，劉永中，李向東*

1 山東農業大學植物保護學院，山東泰安岱宗大街61號 271018；

2 山東濰坊煙草有限公司安丘分公司，山東省安丘市擁翠街129號 262133；

3 黑龍江省煙草科學研究所，黑龍江哈爾濱哈藥路17號 150076

馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的代表種，是危害煙草和馬鈴薯等茄科作物的主要病毒。PVY基因組為正義單鏈RNA，全長約9700核苷酸（nt），5'-端有一個基因組連接蛋白（viral protein genome- linked，VPg），3'-端有 poly（A）[1]。

PVY侵染煙草可引起葉片花葉以及沿葉脈壞死等癥狀，造成煙草減產甚至絕收[2]，嚴重危害煙草生產。明確PVY基因組對鑒定病毒株系，研究其致病機理和指導檢測及防治有重大意義。吳元華等依據生物學方法將東北地區PVY分離物進行株系劃分；萬秀清等[3]通過多重PCR和系統進化分析將黑龍江煙區PVY分離物劃分株系，但未對序列進行重組分析、選擇壓分析等研究。本文測定了2個黑龍江煙草PVY分離物的全基因組序列，并與GenBank中35個PVY分離物進行了一致率、重組、系統發育和選擇壓力等分析，發現兩個分離物均為PVYN-Wi株系，可為黑龍江煙區PVY檢測及抗病育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2個煙草樣品采自黑龍江省哈爾濱市和牡丹江市，分別命名為Harbin和MDJ。大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。植物總RNA提取試劑盒Transzol、DNA凝膠回收試劑盒等均購自北京全式金公司；Phusion超保真DNA聚合酶購自Thermo公司，M-MLV反轉錄酶、pMD18-T克隆載體、LA Taq DNA聚合酶和末端轉移酶購自TaKaRa公司；Super ScriptTMⅣ反轉錄酶購自Invitrogen公司。其他生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物合成

使 用 DNAMAN（version7）對 GenBank中 的PVY序列進行比對，選擇保守片段進行引物設計，引物由北京華大基因公司合成，序列詳見表1。

表1 PVY全基因組擴增引物Tab.1 Oligonucleotide primers used to amplify the complete genome of PVY

1.2.2 植物總RNA提取、RT-PCR擴增及5′RACE

使用Transzol試劑盒提取植物總RNA，以Oligo（DT）15為引物，以M-MLV反轉錄酶進行反轉錄，分三段擴增5′端以外PVY基因組序列。5′端基因組序列由5′RACE獲得，依照Elizabeth等[4]的方法進行。

1.2.3 克隆及序列測定

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外燈下切取目的膠條（2686bp、3777bp和3054bp）。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收PCR產物并連接pMD18-T載體，轉化Escherichia coliDH5α感受態細胞后，藍白斑篩選挑取白色單菌落，經PCR驗證陽性后選取3個克隆送北京華大基因公司測序。

式中,平均輸出電壓為30 V,負載電阻30 Ω,輸出電流為1 A,平均輸入電壓為20 V,則PWM占空比D為0.33,若最小輸入電壓為15 V,變換效率取95%,則滿載時輸入電流為

1.2.4 核苷酸序列一致率分析

測得序列使用DNASTAR軟件包的Seqman軟件進行拼接，通過CLUSTAL X1.81軟件與GenBank中PVY分離物（表2）序列進行比對，使用MegAlign軟件分析2個分離物全基因組與參比序列在氨基酸和核苷酸水平的一致率。

1.2.5 重組分析

比對后的序列用RDP（version4.95）軟件包進行重組分析。通過軟件包中 RDP、GENECONV、BOOTSCAN、MAXCHI、CHIMAERA、SISCAN 和3Seq 共七種算法進行分析。當四種以上算法支持重組，且P＜1.0×10-6時，可認定該分離物存在重組。同時用Simplot（version3.51）驗證重組并繪制重組分析示意圖。

表2 本文分析用的37個PVY分離物序列號及來源Tab.2 Accession number,host and geographical origin of the 37 PVY isolates analyzed in the paper

續表2

1.2.6 系統發育分析

以馬鈴薯A病毒（PVA）芬蘭分離物（Z21670）為外組，使用MEGA7中 CLUSTAL W模塊比對表2中37個PVY分離物的全基因組序列，并采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統進化樹，重復1000次并去掉小于50%的分支。

1.2.7 選擇壓力分析

使用 MEGA7中 Nei-Gojobri method（Jukes-Cantor）算法，分別計算各蛋白的dN/dS值。若dN/dS＞1，說明存在正選擇；若dN/dS＝1，說明存在中性選擇；若dN/dS＜1，說明存在負選擇。

1.2.8 遺傳分化系數

按照寄主來源將參比序列分為煙草和馬鈴薯兩組，使用DnaSP（version5.10）計算兩組序列遺傳分化系數（FST）。若FST＝0，則兩種群基因型完全相似；FST＜0.33，則兩種群基因交流密切；若FST＝1，則兩種群完全隔離。

2 結果

2.1 基因組結構

分離物Harbin和MDJ基因組RNA全長均為9699 nt（GenBank登錄號分別為MH933741和MH933742）。Harbin基因組A、C、G、U的含量為 別 為 31.1%、18.9%、23.4% 和 26.6%，MDJ為31.0%、18.8%、23.5%和26.7%。

2個分離物基因組均包含2個開放閱讀框（ORF）。ORF1起于186 nt，止于9368 nt，編碼一個含有3061個氨基酸的多聚蛋白，該蛋白可被切割為P1、HCPro、P3、6K1、CI、6K2、VPG、NIa、NIb 和 CP 等10個蛋白。兩個分離物蛋白酶P1的識別位點均為Q/G，HC-Pro的識別位點均為G/G，NIa的識別位點為Q/R、Q/S、Q/A、Q/G、E/A、Q/A、Q/A。ORF2起于2921 nt，止于3145 nt，由P3的氨基端滑動轉錄構成PIPO。

2.2 核苷酸和氨基酸一致率

在核苷酸水平上，Harbin、MDJ與分離物GBVC 26全基因組的一致率最高，三者之間均為98.5%，與美國分離物MN一致率最低，分別為85.0%和84.8%。在氨基酸水平上，Harbin和MDJ的一致率最高為99.5%。與美國分離物NC57一致率最低，分別為89.3%和89.2%。在 Harbin和MDJ 編碼的11 個蛋白中，P1 變異最大，核苷酸一致率分別為71.5%～99.4%和71.7%～98.9%，氨基酸一致率分別為62.0%～99.6%和62.3%～99.6%。核苷酸水平上，CP變異最小，兩分離物與其它分離物的一致率分別為89.7%～99.7%和88.5%～99.7%；氨基酸水平上，CI變異最小，兩分離物與其它分離物的一致率分別為95.5%～100%和95.4%～100%（表3和表4）。

圖1 PVY分離物Harbin和MDJ基因組結構示意圖Fig.1 The genomic structure of PVY isolates Harbin and MDJ

表3 Harbin與其他PVY分離物核苷酸/氨基酸的序列一致率Tab.3 Sequence identities（%）between Harbin and other PVY isolates at nucleotide/amino acid levels

表4 MDJ與其他PVY分離物核苷酸/氨基酸的序列一致率Tab.4 Sequence identities（%）between MDJ and other PVY isolates at nucleotide/amino acid levels

2.3 重組結構

經RDP軟件分析，7種軟件都證明Harbin和MDJ均為重組分離物（表5）。兩個分離物均為PVYN株系與PVYO株系分離物的重組體。Harbin分離物主要親本為美國PVYO株系分離物Oz（1-502 nt；2396-9699 nt），次要親本為瑞士PVYN株系分離物N-605（503- 2395 nt）。MDJ分離物主要親本為美國PVYO株系分離物CW（1-508 nt；2518 -9699 nt），次要親本同樣為N-605（509-2517 nt）。Harbin分離物基因組有2個重組位點，分別位于P1基因內和HC-Pro基因的的3'-端，與PVYN-Wi株系重組類型一致；MDJ分離物基因組也有2個重組位點，分別位于P1基因內和P3基因的5'-端。

表5 分離物Harbin與MDJ重組分析Tab.5 Recombination analysis of isolates Harbin and MDJ

2.4 系統進化關系

系統進化分析結果顯示，37個分離物分為9個組，分別對應9個PVY株系類型。其中Harbin和MDJ分離物均屬PVYN-Wi組，同組的還有比利時分離物GBVC 26和波蘭分離物LW。PVYE組的兩個分離物PYVMON和PVYAGA全部來自巴西。PVYNTN-NW組由3個敘利亞分離物和一個德國分離物156var。PVYNTN組由Gr99等4個波蘭分離物組成。PVYN組包含瑞士分離物N-605、中國分離物Guiyang、美國分離物Mont和英國分離物SCRI-N。PVYNA-N/NTN組則由中國分離物ME162、美國分離物RRA1、英國分離物SASA-6和加拿大分離物Tu660組成。PB209等3個美國分離物組成PVYN：O組。美國分離物MN和NC57，意大利分離物NNP，澳大利亞分離物KIP1，法國分離物Adgen和英國分離物CRM1組成PVYC組，加拿大分離物RB和O-139，美國分離物CO1898、Oz和CW以及英國分離物SCRI-O組成PVYO組。

圖2 Harbin與MDJ分離物的重組模式示意圖Fig.2 Recombination pattern of isolates Harbin and MDJ

圖3 Harbin分離物重組分析示意圖Fig.3 Recombination analysis of isolate Harbin

圖4 MDJ分離物重組分析示意圖Fig.4 Recombination analysis of isolate MDJ

2.5 選擇壓力

選擇壓力分析表明，PVY的11個蛋白的dN/dS值均小于1，說明11個蛋白均存在負選擇。其中NIa的dN/dS值最小，為0.02776，而PIPO的dN/dS值最大，為0.38013，說明在PVY的11個蛋白中NIa受到的選擇壓最大，而PIPO最小。

圖5 基于Harbin、MDJ和其他35個PVY分離物全基因組序列構建的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree constructedbased on complete genomic sequences of Harbin,MDJ and other 35 PVY isolates

表6 PVY各蛋白選擇壓力分析Tab.6 Selection pressure analysis of PVY proteins

2.6 遺傳分化系數

將來自煙草和馬鈴薯的PVY分別作為一組，利用DnaSP分析遺傳分化系數。結果表明，兩組PVY間的FST值為0.04424，小于0.33，說明煙草PVY分離物和馬鈴薯PVY分離物間的基因交流非常頻繁。

3 討論和結論

3.1 我國煙田PVY分布及株系演化

1950年，陳瑞泰在山東臨朐首次發現PVY為害煙草[5]。1978-1979年，陳瑞泰等調查黑龍江、山東、四川、遼寧和吉林5省煙區病毒病類型，主要病毒種類為TMV和CMV[6]，PVY并非主要病害。1983年，韓曉東[7]等報道PVY廣泛分布與我國山東、河南、安徽、云南、廣東、遼寧等10個煙區。1991年已擴大到13個省區，1996年則擴大至16個省區[6]。

吳元華等將東北地區煙草PVY分離物分為PVYO（普通株系）、PVYN（脈壞死株系）、PVYNS（莖壞死株系）和PVYC（點刻條斑株系）四個株系，黑龍江地區以PVYN（脈壞死株系）為優勢株系。王勁波[8]等通過生物學方法鑒定山東煙區分為PVYN（壞死株系）和PVYC（普通株系）兩個株系，PVYN（壞死株系）為優勢株系。蔡偉［9］等經系統發育和重組分析鑒定山東、貴州、河南三省煙區PVYNTN-NW為優勢株系。Tian等［10］證明中國煙草PVY可以分為PVYN、PVYO、PVYNTN、PVYN-Wi和 PVYN-HcO等 五個株系，其中3個黑龍江PVY分離物均屬于PVYN-Wi株系。萬秀清等［3］將黑龍江煙草PVY分離物劃分為PVYNTN、PVYN、PVYN-Wi和PVYNTN-NW四個株系。本研究根據系統進化和重組分析結果證明采集的2個PVY分離物均屬于PVYN-Wi株系。綜合以上結果，PVYN-Wi株系是黑龍江煙草PVY的優勢株系。

3.2 MDJ分離物重組位點分析

系統發育分析判定Harbin和MDJ均為PVYN-Wi株系，該株系為重組株系，兩個重組位點通常位于P1和HC-Pro[11]。經重組分析，Harbin分離物重組位點與PVYN-Wi株系株系一致，MDJ分離物的第二個重組位點則位于P3，為新的重組位點。Hu等[12]曾對14個PVYN-Wi株系分離物進行重組分析，發現其中13個分離物的第二個重組位點均位于2395-2398nt處，僅分離物261-4（AM113988）第二個重組位點位于2417 nt處。本文參比序列有4個PVYN-Wi株系分離物，其中Harbin和LW兩個分離物的第二個重組位點均在2395nt，位于HC-Pro 基因3'-末端，與PVYN-Wi株系的重組位置一致。分離物GBVC 26的第二個重組位點在2408nt，其重組位點位于P3基因[13]。MDJ分離物的第二個重組位點在2517 nt，比GBVC 26分離物又后移109 nt，兩個分離物第二個重組位點均位于P3基因的5'-端。MDJ與Harbin兩分離物序列一致率最高，且有相同的地理和寄主來源，但在系統進化樹中，MDJ與Harbin分為兩個分支（圖5），擁有不同的重組類型（圖2）。像MDJ分離物這種重組位點位于P1基因和P3基因內，重組區域包括部分P1基因、整個HC-Pro基因和部分P3基因的分離物可能是一類特殊的PVYN-Wi株系重組分離物。

3.3 煙草PVY毒源

生產上普遍認為PVY在馬鈴薯塊莖上越冬，第二年隨蚜蟲取食馬鈴薯植株傳播到煙草上[14]。本文將煙草PVY分離物與馬鈴薯PVY分離物分組并計算遺傳分化系數，證明二者基因交流頻繁，印證了此觀點。杜絕煙草與馬鈴薯間作以避開初始毒源，并及時防蚜治蚜，切斷傳播途徑，是防治煙草PVY行之有效的方法。本研究從PVY的遺傳分化上為該方法提供了理論依據。

4 結論

本研究測定了黑龍江煙區2個PVY分離物的全基因組序列，進行了一致率、重組、系統進化和選擇壓分析，主要結論如下：

（1）Harbin和MDJ的基因組全長均為9699核苷酸，均為重組體，且MDJ分離物中存在新的重組位點。

（2）PVY根據全基因組序列分為9個組，其中Harbin和MDJ均屬PVYN-Wi組。

（3）PVY的11個基因均處于負選擇，其中NIa的選擇壓力最大。

（4）煙草PVY分離物和馬鈴薯PVY分離物基因交流頻繁。