尼古丁誘導人腸道上皮細胞自噬水平的研究

高茜，楊斌，管瑩，畢品端，黃海濤，曾婉俐，向海英，劉欣，米其利，李雪梅*

1 云南中煙工業(yè)有限責任公司，云南省昆明市高新區(qū)科醫(yī)路41號，650024;

2 昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，云南省昆明市西昌路295號，650032

炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一類慢性、易復發(fā)的消化系統(tǒng)疾病，主要包括潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）和克羅恩病（Crohn's disease，CD）[1]。由于飲食結構的變化，IBD在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷升高趨勢[2]。目前，IBD尚無有效的根治手段，但多數(shù)患者可通過藥物治療使病情得到有效緩解。煙堿，俗名尼古丁，是一種從茄科植物（茄屬）中提取出的三級胺生物堿，也是煙草的重要成分[3]，已被用作潰瘍性結腸炎患者的治療劑[4]。咀嚼尼古丁口香糖可有效控制輕度至中度結腸炎的臨床病癥[5]。盡管如此，尼古丁的作用機制尚不清楚。

自噬是一種特殊的細胞內(nèi)吞噬現(xiàn)象，能夠主動吞噬細胞內(nèi)的受損細胞器、蛋白質(zhì)等內(nèi)容物，降解成氨基酸、核糖等代謝物重新用于生物合成和供能，進而維持細胞穩(wěn)態(tài)[6]。在消化系統(tǒng)疾病最常發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）中，自噬通過消化蛋白聚集物和錯誤折疊蛋白維護內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，限制ERS誘導的細胞凋亡，從而保護消化道細胞[7]。研究證實自噬是消化道炎癥反應的一個重要調(diào)節(jié)靶點。一項GWAS分析顯示自噬基因ATG16L1的多態(tài)性位點與IBD的發(fā)病率存在相關性[8]。這些證據(jù)說明自噬在消化系統(tǒng)疾病中扮演重要角色。本研究的主要目的是觀測尼古丁對上皮細胞自噬的誘導作用及分子機制，了解該機制將有助于為IBD的治療和預防帶來新的策略。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素、lipofectamine 2000均購自美國Thermo公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（Dojindo，日本）；預染蛋白Marker（Thermo公司，美國），兔抗人LC3、Beclin1、p62、β-actin抗體（SantaCruz公司，美國）；BCA蛋白濃度檢測試劑盒（Thermo公司，美國），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（碧云天公司，江蘇）

酶標儀（Tecan，Mannedorf，Switzerland），電泳及轉移系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），Odyssey掃描儀（LiCor公司，美國），分光光度計（Jenway公司，英國），熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 實驗方法和條件

1.2.1 人腸道上皮細胞培養(yǎng)及處理

人腸道上皮細胞（Hunman intestinal epithelial cells，hIECs）來源于中國科學院昆明動物研究所。使用含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃下5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天常規(guī)換液，待細胞增殖至板底面積90%時胰酶消化傳代，第4代hIECs用于后續(xù)實驗，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM。

1.2.2 CCK8檢測細胞增殖情況

使用CCK8試劑盒并根據(jù)使用說明測定細胞活力。將hIECs在96孔板中培養(yǎng)以達到所需的匯合。將細胞與不同濃度的尼古丁（0、2.5、5和10 μM）一起孵育。在尼古丁處理24小時后，向每個孔中加入10 μlCCK-8溶液。再將細胞在37℃下孵育2小時。使用酶標儀（Tecan，Mannedorf，Switzerland）在450nm處讀取吸光度。

1.2.3 Western-blot檢測自噬標志蛋白和mTOR通路相關蛋白的表達

取生長狀態(tài)良好的hIECs，以每孔2×105個細胞的密度接種于六孔板中，待細胞生長至80%后分別給予0、2.5、5和10 μM的尼古丁作用24 h，PBS洗滌后每孔加入120 μL含1 mM蛋白酶抑制劑的細胞裂解液（ridio-immunoprecipition assay，RIPA），在冰上充分裂解后刮取細胞。將細胞裂解混合物移至EP管中，4 ℃、12 000 r離心15 min。收集上清，采用BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。每孔進樣總蛋白30 μg，進行SDS-PAGE蛋白電泳。電泳分離蛋白后，采用恒流200 mA的濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上。5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h后，孵育一抗（LC3B，1:300稀釋；Beclin1，1:500稀釋；p62，1:500稀釋；β-actin，1:1000稀釋），4 ℃過夜。室溫孵育二抗2 h后，進行化學發(fā)光檢測。以β-actin為內(nèi)參，計算LC3BII、Beclin1、p62與內(nèi)參的灰度值的比值，得出各個蛋白的相對表達量。

1.2.4 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察hIECs內(nèi)自噬體的形成情況

取生長狀態(tài)良好的hIECs，制備成密度為2×105個/mL細胞懸液，取2 mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至80%后，實驗組給予0、2.5、5和10 μM的尼古丁作用24 h，胰蛋白酶消化后制成密度為1×106個/mL細胞懸液，4℃、1 200 r離心5 min后棄上清，加入1 mL預冷2.5%戊二醛固定，4℃過夜，根據(jù)文獻[13]的操作步驟進行后續(xù)實驗操作。

1.2.5 GFP-LC3自噬斑點檢測

取生長狀態(tài)良好的hIECs，以每孔2×105個細胞的密度接種于6孔板，待細胞生長至80%時，使用lipofectamine 2000將GFP-LC3質(zhì)粒轉染細胞。轉染24 h后，再給予0、2.5、5和10 μM的尼古丁作用24 h。使用倒置熒光顯微鏡（Olympus FV1000，Tokyo，Japan）進行圖像采集。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用單因素方差分析檢驗組間差異，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 尼古丁對細胞形態(tài)的影響

人腸道上皮細胞hIECs在常規(guī)細胞培養(yǎng)條件下，呈現(xiàn)出不規(guī)則的形態(tài)，并且單層細胞為貼壁生長的，細胞核較大，而細胞質(zhì)相對較少。2.5 μM尼古丁處理的細胞的形態(tài)更傾向于正常細胞形態(tài)，僅有少部分細胞出現(xiàn)形態(tài)變化。而10 μM尼古丁作用細胞后，細胞核固縮，細胞體積變小、形狀變圓，脫壁細胞越來越多，但是它的細胞膜突起反而變少（圖1）。

圖1 不同濃度尼古丁對于結腸上皮細胞形態(tài)的影響Fig.1 The effect of different concentrations of nicotine on hIEC morphology

2.2 尼古丁對細胞增殖的影響

進一步采用CCK8法檢測尼古丁對細胞增殖的影響。結果發(fā)現(xiàn)，隨著尼古丁濃度的增加，人腸道上皮細胞的增殖明顯受到抑制。2.5 μM尼古丁對細胞增殖抑制程度較低；而5 μM和10 μM尼古丁顯著抑制細胞增殖（圖2）。

圖2 不同濃度尼古丁對于結腸上皮細胞增殖的影響Fig.2 The effect of difference concentrations of nicotine on hIEC proliferation

圖3 尼古丁對自噬標志物表達水平的影響Fig.3 The expression of LC3B-II,p62 and Beclin1 protein in hIEC treated with nicotine

2.3 尼古丁對細胞中自噬標志物的影響

Western blot結果如圖3A所示：尼古丁作用24h后，與空白對照組相比，Beclin1和LC3B-II表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且這一升高趨勢呈現(xiàn)濃度依賴（圖3B和圖3D）。p62在正常細胞中高表達，不同濃度的尼古丁處理后，其表達水平顯著降低（P＜0.05）（圖3C）。這說明尼古丁能夠引起自噬標志性蛋白表達水平的改變。

2.4 尼古丁作用后細胞內(nèi)自噬小體的形成以及數(shù)量變化

不同濃度的尼古丁作用細胞24 h后行TEM觀察。與未處理組相比，尼古丁處理后細胞出現(xiàn)多個雙層的自噬泡，并形成自噬小體（黑色箭頭示）。統(tǒng)計學結果顯示，尼古丁處理后細胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量明顯增高，但不同濃度之間無統(tǒng)計學差異（圖4）。

圖4 尼古丁誘導的電鏡下自噬小體的數(shù)量變化Fig.4 The change of number of autophagosomes in hIECs treated with nicotine by TEM

2.5 尼古丁對GFP-LC3轉染細胞中自噬斑點的影響

將GFP-LC3轉染至待測細胞，并通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀測、定量GFP-LC3的熒光亮點，是目前應用較為廣泛的哺乳動物細胞自噬檢測技術。本研究利用該技術手段對尼古丁誘導的自噬進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)未處理的細胞中綠色，熒光亮點數(shù)量均很低，而隨著尼古丁處理濃度的增加，細胞中綠色熒光亮點數(shù)量顯著增加，但不同濃度之間無統(tǒng)計學差異（圖5）。

圖5 尼古丁誘導的GFP-LC3自噬斑點的數(shù)量變化Fig.5 The change of number of nicotine-induced spots of LC3 in hIECs by GFP-LC3 assay

2.6 尼古丁誘導自噬的分子機制

已有的文獻推測尼古丁誘導自噬的分子機制，一方面可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關，另一方面可能與mTOR信號通路相關。采用western blot方法，對這兩條信號通路上的關鍵因子進行檢測。結果如圖6所示，尼古丁可以增加ERS關鍵因子GRP78，以及下游信號通路中ATF/IRE1的表達水平。同時，尼古丁能夠激活AMPK蛋白的磷酸化，并抑制Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平，誘導自噬。

圖6 尼古丁誘導自噬的分子機制：激活 ERS和抑制mTOR信號通路Fig.6 Molecular mechanisms of nicotine-induced autophagy:activation of ERS and inhibition of mTOR signaling pathways

3 討論

炎癥性腸病（IBD）是由易感基因，環(huán)境和免疫系統(tǒng)之間一系列復雜的相互作用所導致的[9]。功能失調(diào)的自噬被認為是許多慢性炎性疾病的發(fā)病因素，包括炎癥性腸病（IBD）。自噬在IBD發(fā)病機制中起多重作用。實驗研究發(fā)現(xiàn)采用2.5 μM的尼古丁處理細胞，能夠成功誘導細胞發(fā)生自噬。Marjolaine等[10]的研究中，他們采用100 nM的尼古丁誘導2 h同樣成功誘導自噬，但并未誘導細胞發(fā)生較高水平凋亡，這暗示低濃度的尼古丁對細胞的保護作用很可能是通過自噬來調(diào)控。在本研究中，低濃度劑量（2.5 μM）的尼古丁對于細胞的增殖無明顯的抑制作用；而當劑量達到或超過5 μM時，會產(chǎn)生細胞毒性。因此，實驗采用低劑量（2.5 μM）尼古丁刺激細胞，成功誘導細胞自噬反應。在2.5 μM尼古丁的作用下，hIECs的細胞自噬標志物Beclin1和LC3B-II蛋白表達顯著升高，p62明顯受到抑制。Beclin1存在于反面高爾基網(wǎng)上面，它是酵母Atg6基因在哺乳動物中的同源類似物，與自噬前體結合后啟動自噬體的形成，因此為開啟自噬所必須[11]。LC3B存在兩種形式，LC3B-I和他的水解衍生物LC3B-II。其分別位于細胞質(zhì)和自噬體的胞膜。當細胞發(fā)生自噬時，LC3B-I就會被水解為LC3B-II。因此，LC3B-II常被用作自噬評估的公認指標。p62與LC3偶聯(lián)在一起，可以當作調(diào)節(jié)因子的一種，作用于自噬體的形成，但是它在自噬過程的中、晚期的時候被降解，也常作為追蹤自噬的指標[12]。因此，通過了解上述自噬標志物的表達水平，可對細胞的自吞噬活性進行動態(tài)監(jiān)測和判斷。此外，本研究還通過TEM從組織學水平證實細胞質(zhì)內(nèi)自噬體的形態(tài)及數(shù)量變化同樣受尼古丁作用的影響。這些結果均為本研究中低濃度尼古丁誘導自噬提供了證據(jù)。

目前，臨床上廣泛使用的IBD治療劑與自噬均密切相關，包括類固醇、5-氨基水楊酸、硫銼嘌呤等[7]，均能誘導細胞自噬的發(fā)生。而本研究在人腸道上皮細胞中同樣證實尼古丁同自噬密切相關。這同目前UC臨床上對尼古丁的使用相一致。研究普遍認為吸煙可以提供對UC患者的保護[13]。一項薈萃分析證實，與非吸煙的人群相比，吸煙人群患UC的風險顯著降低[OR 0.58（0.45-0.75）][14]。此外，吸煙的UC患者的住院率、復發(fā)率和結腸切除手術率較非吸煙的UC患者均顯著降低[15]。雖然吸煙的影響與尼古丁的影響不盡相同，但有臨床證據(jù)表明，尼古丁和/或其代謝產(chǎn)物（如可替寧）是活動性UC患者從吸煙中獲益的主要原因。尼古丁在人體內(nèi)的半衰期約為2小時，而可替寧是尼古丁代謝的副產(chǎn)物，可在血液中存留48小時。尼古丁起效快，代謝產(chǎn)物存留時間長，且血漿蛋白結合率小于5%，合并用藥對于藥代動力學影響甚微[16]。因此，充分了解尼古丁在UC中的機制將為IBD的治療和預防帶來新的策略。

本實驗研究進一步檢測尼古丁誘導自噬的分子機制。腸道上皮細胞極易受到ERS影響，其結果是自噬的激活以及自噬通量的增加[17,18]。已有的研究證實尼古丁與ERS密切相關。Wong等[19]發(fā)現(xiàn)尼古丁能直接誘導ERS，上調(diào)ERS標志物PERK、eif2a等表達或磷酸化修飾。本研究也顯示尼古丁上調(diào)GRP78/BIP的表達水平，啟動ERS，這可能是尼古丁誘導自噬的一個機制。mTOR激酶是誘導自噬的重要調(diào)節(jié)分子，mTOR信號通路能夠同體內(nèi)微環(huán)境協(xié)同調(diào)節(jié)細胞生長和存活[20]。多項研究表明，mTOR介導的自噬在IBD過程中扮演重要角色[20-22]。一方面，上游Akt和 MAPK信號通路能夠激活 mTOR抑制自噬；另一方面，AMPK和 p53信號通路能夠負性調(diào)節(jié)mTOR促進自噬[23]。對AMPK、Akt介導的mTOR信號通路進行的檢測結果顯示尼古丁能夠增加AMPK的磷酸化水平，降低Akt的磷酸化水平，最終導致mTOR受到抑制，進而誘導自噬。此外，Akt/mTOR也是細胞凋亡的重要通路[24]。這可能與高濃度尼古丁促進細胞凋亡，抑制細胞增殖相關。因此，尼古丁在UC的治療作用很可能取決于使用濃度。

綜上所述，自噬在UC的治療中起著重要作用，自噬調(diào)節(jié)類藥物作為IBD的潛在治療靶點會受到越來越多的關注。低濃度尼古丁能夠誘導自噬，與ERS和mTOR信號通路密切相關，進一步對該分子機制進行研究，有助于開發(fā)調(diào)節(jié)自噬治療UC的新治療靶點。