免疫組化法在結(jié)核病理診斷中的應(yīng)用

雷戰(zhàn)平

【摘要】 目的：分析免疫組化法在結(jié)核病理診斷中的應(yīng)用。方法：選擇湖南省胸科醫(yī)院2015年1月-2017年9月確診為結(jié)核病的79例患者，均對(duì)其行免疫組化法檢測(cè)，對(duì)所有患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果：抗酸桿菌（AFB）檢出26例，檢出率為32.91%，BCG抗原檢出54例，檢出率68.35%，AFB檢出率明顯低于BCG抗原檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=9.868 9，P<0.05）。AFB、BCG抗原在結(jié)核結(jié)節(jié)、滲出性結(jié)核中的檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;BCG抗原檢測(cè)率在干酪樣壞死灶、不完全壞死灶、纖維化鈣化灶、壞死灶旁纖維組織中高于AFB，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蛛網(wǎng)膜下腔和肝中，AFB、BCG抗原檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;BCG抗原檢出率在肺、肺門淋巴結(jié)、頸淋巴結(jié)中檢出率高于AFB，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。13例原發(fā)性肺結(jié)核中，AFB檢出7例，檢出率為53.85%，BCG抗原檢出檢出8例，檢出率為61.54%，在原發(fā)型肺結(jié)核中檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=3.075 3，P>0.05）;39例繼發(fā)性肺結(jié)核中，AFB檢出13例，檢出率為33.33%，BCG抗原檢出24例，檢出率為61.54%，BCG抗原檢出率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=9.896 3，P<0.05）。結(jié)論：免疫組化法應(yīng)用在結(jié)核病診斷為較好的診斷方法，值得借鑒。

【關(guān)鍵詞】 免疫組化法; 結(jié)核病; 診斷

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.07.033 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2019）07-00-03

肺結(jié)核是發(fā)生在肺組織、氣管、支氣管和胸膜的結(jié)核病變，結(jié)核分枝桿菌是人類結(jié)核病的病原菌，常作為結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。診斷結(jié)核疾病的方法有多種，如X線、抗酸染色、PPD試驗(yàn)及病理切片等。然而X線出現(xiàn)誤診或漏診的概率較大，且該檢查方法費(fèi)用較高，操作較為復(fù)雜[1]。PPD試驗(yàn)雖為檢測(cè)該疾病的常用方法，但其假陽性較高;病理切片方法診斷率較高，但由于檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，因而要尋求新的檢測(cè)方法，如免疫組化法。本研究選擇筆者所在醫(yī)院收治的79例患者作為研究對(duì)象，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇湖南省胸科醫(yī)院2015年1月-2017年9月確診為結(jié)核病的79例患者，所有病例符合國家衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)，咳嗽、咳痰≥2周，或痰中帶血或咯血為肺結(jié)核可疑癥狀。其中男37例，女42例，患者年齡3～75歲，平均（49.76±7.85）歲，病程2～7個(gè)月，平均（3.86±0.96）個(gè)月;結(jié)核感染部位：肺結(jié)核27例，淋巴結(jié)核30例，其他部位22例;結(jié)核病變：結(jié)核結(jié)節(jié)31例、干酪樣壞死灶39例、滲出性結(jié)核32例、不完全壞死灶33例、纖維化鈣化灶33例、壞死灶旁纖維組織13例;器官：肺27例、肺門淋巴結(jié)21例、頸淋巴結(jié)9例、蛛網(wǎng)膜下腔13例、肝9例;原發(fā)性肺結(jié)核13例、繼發(fā)性肺結(jié)核39例，肺外結(jié)核27例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法 （1）石蠟標(biāo)本制作：樣本（肺及淋巴結(jié)等）取出后將其立即放入福爾馬林中，濃度為10%，24 h后行脫水（采用乙醇）處理，而后進(jìn)行透明處理，采用的是二甲苯（PX），2 h后將雜質(zhì)去除，石蠟包埋。（2）制片：將石蠟切開呈片狀，厚度以4 μm為宜，將蒸餾水（1 ml）滴在載玻片上并烘干，使用恒溫水浴鍋。（3）磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，5 min/次，在標(biāo)本上滴過氧化氫的甲醇溶液，時(shí)間以12 min為宜;沖洗后封閉，30 min后將多余液體傾出。（4）將卡介苗（BCG）多克隆抗體一抗適量加入并過夜，溫度以4 ℃為宜，次日再次PBS沖洗5 min，沖洗3次。（5）將適量二抗加入，15 min后再次PBS沖洗，沖洗次數(shù)同上。（6）二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色：將DAB顯色劑滴在組織標(biāo)本上，其染色程度需借助顯微鏡，而后行PBS沖洗，10 min后停止。（7）復(fù)染，采用的蘇木精，4 min后用酒精分化，而后進(jìn)行沖洗（19 min）。（8）常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯處理后，中性樹膠封片。

1.2.2 抗酸染色 另外對(duì)所有患者標(biāo)本（肺及淋巴結(jié)等）進(jìn)行抗酸染色，檢測(cè)抗酸桿菌（AFB）。步驟：（1）火焰固定;（2）滴加石炭酸復(fù)紅染液，在火焰高處徐徐加溫至冒蒸氣，并維持5 min（注意切勿讓染液沸騰或煮干），當(dāng)染液蒸發(fā)減少時(shí)，需再加染液補(bǔ)充。待標(biāo)本片冷卻后水洗;（3）用3%鹽酸酒精脫色，至無肉眼可見紅色為止后（反復(fù)2～3次，一般需要1～2 min）水洗;（4）用堿性美藍(lán)復(fù)染1 min，水洗。

1.3 觀察指標(biāo)

比較結(jié)核檢出率;比較抗酸桿菌（AFB）、卡介苗（BCG）抗原在各結(jié)核病變中的檢出率;比較AFB、BCG抗原在不同器官中檢出率;比較原發(fā)、繼發(fā)性肺結(jié)核的AFB、BCG抗原檢出率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核檢出率比較

79例患者中，檢出AFB 26例，檢出率為32.91%，檢出BCG抗原54例，檢出率為68.35%，AFB檢出率明顯低于BCG抗原檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=9.868 9，P<0.05）。

2.2 AFB、BCG抗原在各結(jié)核病變中的檢出率比較

AFB、BCG抗原在結(jié)核結(jié)節(jié)、滲出性結(jié)核中的檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;BCG抗原檢測(cè)率在干酪樣壞死灶、不完全壞死灶、纖維化鈣化灶、壞死灶旁纖維組織中高于AFB，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 AFB、BCG抗原在不同器官中檢出率比較

蛛網(wǎng)膜下腔和肝中，AFB、BCG抗原檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;BCG抗原檢出率在肺、肺門淋巴結(jié)、頸淋巴結(jié)中檢出率高于AFB，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 原發(fā)、繼發(fā)性肺結(jié)核的AFB、BCG抗原檢出率

13例原發(fā)性肺結(jié)核中，AFB檢出7例，檢出率為53.85%，BCG抗原檢出檢出8例，檢出率為61.54%，在原發(fā)型肺結(jié)中核的檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=3.075 3，P>0.05）;39例繼發(fā)性肺結(jié)核中，AFB檢出13例，檢出率為33.33%，BCG抗原檢出24例，檢出率為61.54%，BCG抗原檢出率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=9.896 3，P<0.05）。

3 討論

結(jié)核病是一種傳染性疾病，現(xiàn)如今我國患該疾病的概率較高，每年約130萬[2]，WHO及我國較關(guān)注該疾病的防治。該疾病有較為廣泛的傳播途徑，如食物、空氣等，有較大的危害性，患病后會(huì)使其心理、生理受到不良影響。社會(huì)在發(fā)展，抗結(jié)核藥物也相繼上市，降低了全球結(jié)核疾病的感染率，這些藥物包括利福平、異煙肼等。然隨著人類免疫缺陷病毒的出現(xiàn)，加上結(jié)核分枝桿菌的變異，使部分患者對(duì)抗結(jié)核藥物耐藥，使結(jié)核疾病再次被WHO的重視[3-4]。結(jié)核疾病由感染結(jié)核分枝桿菌所致，該病菌的形狀是彎曲的，呈細(xì)長(zhǎng)型，大量脂質(zhì)存儲(chǔ)在細(xì)胞壁內(nèi)，脂質(zhì)量多時(shí)可阻止一般的消毒劑進(jìn)入胞內(nèi)，具體為對(duì)外界環(huán)境（如自然環(huán)境、酸、堿等）的抵抗力較強(qiáng)，但濕熱、紫外線及酒精可透過脂質(zhì)，進(jìn)入胞內(nèi)。結(jié)核疾病在早期治療可減少其對(duì)機(jī)體內(nèi)其他臟器的破壞減少或不對(duì)其造成損害[5-6]。

現(xiàn)如今分子生物學(xué)發(fā)展迅速，可使用免疫組化技術(shù)對(duì)其檢測(cè)。該檢測(cè)方法可將組織固定在福爾馬林溶液中，致使組織中的抗原蛋白發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，封閉部分抗原決定簇，將抗原免疫反應(yīng)活性降低，使BCG檢出率減低。要克服此種現(xiàn)象，在染色時(shí)解除組織固定時(shí)所形成的交聯(lián)現(xiàn)象，暴露或恢復(fù)抗原。由本次研究結(jié)果可知，免疫組化技術(shù)檢出率較高，為68.35%，喻永澤等[7-8]采用免疫組化法診斷結(jié)核疾病，其準(zhǔn)確率為71.38%，本次研究結(jié)果與之相符。由此提示，對(duì)于結(jié)核疾病患者使用免疫組化技術(shù)有較高的檢出率。有研究顯示，AFB較少表達(dá)慢性結(jié)核疾病，如纖維化鈣化灶、廣泛干酪樣壞死區(qū)等，然對(duì)其行BCG陽性率較高[9-10]，結(jié)合本次研究結(jié)果，慢性結(jié)核疾病使用AFB檢出率較低，而BCG檢測(cè)率較高，與之相符，由此提示BCG抗原檢測(cè)適用于AFB陰性、結(jié)核組織病變不典型患者。但亦有報(bào)道顯示，對(duì)于滲出性結(jié)核病使用BCG檢測(cè)，其檢測(cè)率明顯低于抗酸染色檢測(cè)率。由此證明要更為準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)核疾病，可聯(lián)合使用此兩種檢測(cè)方法[11]。BCG抗原檢測(cè)有較高的陽性率，除外陳舊性結(jié)核疾病，可能是由于隨著疾病的進(jìn)展，結(jié)核菌抗原突變，其性質(zhì)、成分發(fā)生改變。有學(xué)者給動(dòng)物注射BCG，開始出現(xiàn)結(jié)核時(shí)抗原成分未消失，包括AFB、多糖1及菌蛋白B1等，隨著病情發(fā)展，出現(xiàn)干酪樣壞死灶時(shí)上述抗原菌消失，但使用其他免疫組化染色（抗臘質(zhì)D抗體及抗整個(gè)結(jié)核菌）時(shí)，顯示陽性[12]。本次研究中使用的不是單克隆抗BCG，可結(jié)合多種BCG抗原，進(jìn)而較好地將急性、慢性疾病顯示。

綜上所述，免疫組化法能有效地提高結(jié)核病的診斷率，值得借鑒。

參考文獻(xiàn)

[1]楊文軍.肺結(jié)核不典型X線CT影像學(xué)表現(xiàn)及誤診漏診原因分析[J].中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2014，6（2）：11-12.

[2]劉慶榮，賀曉新，曹凱，等.2005～2013年北京地區(qū)肺結(jié)核病時(shí)間流行特征及預(yù)測(cè)[J].中國醫(yī)刊，2015，65（5）：105-107 .

[3]張洪蘭，張昶，陳昊.全自動(dòng)與手工免疫組化法在檢測(cè)5種惡性腫瘤Her-2表達(dá)中的應(yīng)用[J].診斷病理學(xué)雜志，2016，23（10）：796-797.

[4]楊榮，武振華，王玉玲，等.非小細(xì)胞肺癌中HER-2和EGFR的表達(dá)及其與臨床表現(xiàn)的關(guān)系[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2014，30（7）：801-803.

[5]龍曉雨，步宏，魏兵，等.雙色銀染原位雜交與熒光原位雜交檢測(cè)胃癌患者HER2基因狀態(tài)[J].中華病理學(xué)雜志，2011，40（5）：300-303.

[6]王春花，龐學(xué)文，傅衍勇.非結(jié)核分枝桿菌相關(guān)研究新進(jìn)展[J].結(jié)核病與肺部健康雜志，2015，4（1）：61-65.

[7]喻永澤.免疫組化技術(shù)、原位雜交技術(shù)用于結(jié)核病診斷中的價(jià)值評(píng)價(jià)[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2017，11（3）：55-56.

[8]于兵兵，劉艷峰，胡延濤，等.免疫組化技術(shù)、原位雜交技術(shù)檢測(cè)尖銳濕疣結(jié)果對(duì)比分析[J].心理醫(yī)生，2015，21（22）：135-136.

[9]丁玉龍.白細(xì)胞介素-17A及骨橋蛋白在肺結(jié)核治療過程中免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2017：1-107.

[10]丁佩佩，何綱，陳曉華，等.HIV/HCV共感染者外周血輔助性T細(xì)胞17和IL-17A水平檢測(cè)[J].實(shí)用肝臟病雜志，2015，18（1）：30-33.

[11]覃松梅，羅谷容.結(jié)核抗體檢測(cè)對(duì)照BCG-PPD皮試的診斷價(jià)值初探[J].廣西醫(yī)學(xué)，2001，23（2）：329-330.

[12]梁媛，馮洋洋，李琳琳，等.MicroRNA-29a靶向抑制PTEN基因誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2018，26（5）：653-659.