羥尼酮治療四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

肝纖維化是指由各種致病因子所致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積的病理過程。它不是一種獨(dú)立的疾病，許多因素均可引起肝纖維化，包括乙醇、病毒性肝炎、藥物、毒素、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性疾病和代謝紊亂等[1]。肝纖維化是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，由ECM合成和降解失衡導(dǎo)致ECM過度沉積所致，可能發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌，甚至引起患者死亡[2]，隨著其病死率不斷升高，肝纖維化已成為全球性健康問題[3-4]。然而，越來越多的證據(jù)表明肝纖維化是動(dòng)態(tài)的，是可以逆轉(zhuǎn)的[5]，但目前尚無有效治療人肝纖維化的方法。

近年來，吡非尼酮(F647)已被批準(zhǔn)為治療特發(fā)性肺纖維化的新型藥物[6]，其衍生物PBD-617在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)有抗肺纖維化作用，其作用機(jī)制為抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)信號(hào)[7]，亦有不少研究表明F647具有抑制心、腎、肝等纖維化的作用[8]。本文研究F647的同分異構(gòu)體羥尼酮(F351)對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備

6周齡BALB/c雄性小鼠(購自上海市西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)104只，平均體質(zhì)量20～25 g，分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。在動(dòng)物房適應(yīng)2 d后將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組6只，造模組98只。造模3周后，生存小鼠按隨機(jī)數(shù)表法進(jìn)行分組：模型3周組6只，模型組12只，利加隆組10只，F(xiàn)351-100 mg/kg組10只，F(xiàn)351-30 mg/kg組10只，F(xiàn)351-10 mg/kg組10只，F(xiàn)351-3 mg/kg組10只，F(xiàn)351-1 mg/kg組10只，F(xiàn)647-100 mg/kg組10只，F(xiàn)647-30 mg/kg組10只。20% CCl4橄欖油溶液(0.5 mL/100g，其中CCl4購自蘇州三杰化學(xué)品有限公司，分析純；橄欖油購自上海嘉里食品工業(yè)有限公司)腹腔注射給藥，每日1次，維持7周，誘導(dǎo)肝纖維化模型。自第3周后，F(xiàn)351、F647、利加隆(F351及F647均由上海睿星基因技術(shù)有限公司提供，利加隆購自德國馬博士大藥廠)各組根據(jù)小鼠質(zhì)量配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的液體(10 mL/kg)，通過灌胃給藥，每日1次，共4周。其中模型3周組在第3周末取材觀察肝組織纖維化程度，以提供用藥前模型病理資料。末次給藥結(jié)束后次日，心臟取血，分離血清；定位留取肝組織，10%福爾馬林固定；定位留取肝組織于-70℃冷藏備檢。

1.2 血清肝功能檢測(cè)

小鼠取血后室溫靜置1 h，應(yīng)用低溫高速離心機(jī)(Beckman CS-15R型)以3 000 r/min離心15 min，分離血清，用血清自動(dòng)生物化學(xué)檢測(cè)儀(Olympus公司)檢測(cè)血清肝功能，包括總膽紅素(TBIL)、間接膽紅素(IBIL)、直接膽紅素(DBIL)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總蛋白(TP)及白球比(A/G)。

1.3 肝組織羥脯氨酸檢測(cè)

嚴(yán)格按照羥脯氨酸試劑盒(羥脯氨酸試劑盒購自南京建成科技有限公司)完成肝組織羥脯氨酸檢測(cè)，原理為羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲酸作用呈現(xiàn)紫紅色，根據(jù)其呈色的深淺可推算出其含量。

1.4 肝組織中TGF-β1及α-SMA表達(dá)的檢測(cè)

石蠟切片經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察組織病變并進(jìn)行GS分級(jí)，肝纖維化程度S0-S4期判定標(biāo)準(zhǔn)：S0，匯管區(qū)無肝纖維化；S1，匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，局限竇周及小葉內(nèi)纖維化；S2，匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；S3，纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；S4，早期肝硬化。免疫組織化學(xué)檢測(cè)觀察TGF-β1及α-SMA的表達(dá)，通用型二抗購自長(zhǎng)島生物科技有限公司，兔抗人TGF-β單克隆抗體一抗及鼠抗人α-SMA單克隆抗體一抗均購自Bioworld生物科技有限公司，免疫組織化學(xué)試劑盒(ABC法)購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的死亡情況和體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量

每次CCl4造模前(每周一、周四)各組小鼠稱重，造模及給藥過程中觀察小鼠的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)存活及死亡數(shù)量。7周末各組小鼠心臟取血，留取肝組織，并稱量肝臟質(zhì)量。見表1。

表1 各組小鼠存活、死亡情況和體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量

2.2 各組血清肝功能情況

與正常對(duì)照組相比，7周造模組血清ALT、AST水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)351各組的ALT、AST水平均較7周造模組下降，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；7周造模組的血清TBIL、IBIL、DBIL水平較正常對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)351各組較7周造模組均下降，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。詳見表2。

2.3 各組的羥脯氨酸含量

與正常對(duì)照組相比，7周造模組羥脯氨酸含量明顯升高，F(xiàn)351-100 mg、F351-30 mg、F647-100 mg、F647-30 mg及利加隆組的羥脯氨酸含量較7周造模組下降，且P<0.05。見表3。

表2 各組的血清肝功能情況

表3 各組肝組織羥脯氨酸含量

注：與7周造模組相比，aP<0.05

2.4 肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

對(duì)肝組織切片進(jìn)行HE染色及Masson染色，光鏡下觀察其病理改變，可見7周造模組與正常組相比，纖維條索增多，假小葉形成，F(xiàn)351-100 mg治療組小鼠肝組織顯示肝小葉結(jié)構(gòu)的破壞得到修復(fù)。見圖1、圖2。根據(jù)Scheuer評(píng)分方法，對(duì)各組標(biāo)本肝纖維化分期進(jìn)行閱片計(jì)分統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表4。

與7周造模組相比，F(xiàn)351-100 mg、F351-30 mg、F647-100 mg、 F647-30 mg及利加隆組的纖維化程度均有所減輕；觀察F351組間量效關(guān)系可知，F(xiàn)351-30 mg/kg劑量開始有顯著好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，且F351-100 mg/kg更優(yōu)于F351-30 mg/kg，并且均優(yōu)于F647等劑量效果。見圖3。

圖1 肝組織HE染色 ×100A正常對(duì)照組B7周造模組CF351-100 mg組

圖2 肝組織Masson染色 ×100A正常對(duì)照組B7周造模組CF351-100 mg組

表4 各組肝纖維化的分期結(jié)果/例

注：“—”表示無數(shù)據(jù)。與7周造模組相比，aP<0.05

圖3 各組肝纖維化評(píng)分柱狀圖

2.5 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝組織中TGF-β1及α-SMA的結(jié)果

與正常組相比，7周造模組肝組織TGF-β1 及α-SMA表達(dá)升高，F(xiàn)351-100 mg組與造模組相比則表達(dá)降低。見圖4、圖5。

圖4 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝組織中TGF-β1的表達(dá) ×100A正常對(duì)照組B7周造模組CF351-100 mg組

圖5 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝組織中α-SMA的表達(dá) ×100A正常對(duì)照組B7周造模組CF351-100 mg組

3 討論

肝纖維化由各種慢性肝病進(jìn)展所致，雖然肝臟有強(qiáng)大的再生能力，但是慢性持續(xù)的損傷性刺激終將導(dǎo)致肝纖維化[9-11]。目前肝纖維化已成為全球性健康問題，其以膠原纖維過量沉積及肝星狀細(xì)胞(HSC)活化為特征[12-15]，在正常肝臟中，HSC維持著非增殖和靜止的表型，然而在肝損傷時(shí)，HSC被激活[16]，在肝纖維化過程中起著重要的作用[17]。HSC的活化和增殖，將在肝纖維化發(fā)病過程中產(chǎn)生ECM蛋白，包括Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和α-SMA，這些蛋白質(zhì)被認(rèn)為是纖維化的標(biāo)志物，參與了一系列的炎性反應(yīng)和纖維化過程[18]。多種細(xì)胞因子參與了肝纖維化過程，TGF-β1在肝纖維化進(jìn)程中被認(rèn)為是目前眾多細(xì)胞因子中最重要的一種[19]，其在急慢性肝損傷后由庫普弗細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞和血小板分泌[20]，可通過激活靜止的HSC促進(jìn)新基質(zhì)成分的合成；另一方面，可通過增加金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)等酶的合成，抑制ECM的降解[21]。星狀細(xì)胞是ECM的主要產(chǎn)生細(xì)胞，抑制HSC活化可成為治療肝纖維化的重要措施[12-14]。

CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化在形態(tài)學(xué)上與人肝纖維化相似，因此被廣泛應(yīng)用于肝纖維化模型的建立[22]。本實(shí)驗(yàn)中CCl4造模成功后，7周造模組血清ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL及肝組織羥脯氨酸含量較正常對(duì)照組顯著增加，而F351各組上述指標(biāo)較7周造模組均降低。這些結(jié)果表明F351對(duì)CCl4所致小鼠慢性肝損傷有治療作用。肝組織病理觀察纖維化程度可知，F(xiàn)351-30 mg/kg劑量開始對(duì)CCl4所致小鼠肝纖維化有顯著治療作用，且F351-100 mg/kg的效果優(yōu)于F351-30 mg/kg。各種原因所致的慢性肝損傷均可導(dǎo)致HSC活化，活化的星狀細(xì)胞是ECM的主要來源。活化的HSC可表達(dá)TGF-β及α-SMA，因此α-SMA增多提示HSC活化，其是肝纖維化的標(biāo)志物[23]。TGF-β是目前已知最強(qiáng)烈的纖維化促進(jìn)因子。本實(shí)驗(yàn)中免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，7周造模組的TGF-β1及α-SMA表達(dá)水平較正常組升高，各用藥組尤其是F351-100 mg組的TGF-β1及α-SMA表達(dá)水平比7周造模組顯著降低。因此，F(xiàn)351可能通過抑制HSC活化及抑制TGF-β經(jīng)典信號(hào)通路達(dá)到抗纖維化的作用。

綜上所述，F(xiàn)351對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化有治療作用，其作用機(jī)理可能與肝細(xì)胞保護(hù)及抑制HSC活化、減少TGF-β1的表達(dá)有關(guān)。