長鏈非編碼RNA CDRT8通過調(diào)控YAP1表達(dá)對食管癌TE-1增殖的影響

食管癌是中國常見的惡性腫瘤之一[1]。雖然近年來食管癌的手術(shù)切除率較之前有所升高，并發(fā)癥下降，但是總體治療效果仍不盡如人意[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼單鏈RNA，越來越多的研究表明，lncRNA在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。本研究擬通過檢測食管癌組織中l(wèi)ncRNA-CDRT8的表達(dá)水平，并采用質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察CDRT8對食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取利川市人民醫(yī)院心胸外科2016年4月至2018年1月手術(shù)切除的13例食管癌及癌旁組織，術(shù)前患者均未行任何輔助治療，術(shù)后均經(jīng)病理證實為食管癌。本研究獲本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者對研究方案簽署知情同意書。標(biāo)本取出后立即存放于液氮罐內(nèi)保存。

1.2 材料

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。人食管癌細(xì)胞株TE-1購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。Trizol試劑盒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。實時熒光定量PCR(qPCR)相關(guān)試劑盒購自美國Promega公司。CDRT8-shRNA質(zhì)粒(5′-UACCAUCUCACUCAGUCCCUG -3′)及陰性對照質(zhì)粒購自廣州市銳博生物科技有限公司。細(xì)胞周期檢測試劑盒和噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。一抗β-actin、Yes相關(guān)蛋白1(YAP1)、細(xì)胞周期蛋白E(Cyclin E)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)購自美國BD公司。

1.3 總RNA抽提及qPCR檢測

采用Trizol試劑一步法分別提取組織或細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照qPCR試劑盒說明書，以GAPDH為內(nèi)參分別進行qPCR擴增，檢測CDRT8和YAP1基因表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

TE-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天，將TE-1細(xì)胞接種于六孔板，要求轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度為60%，轉(zhuǎn)染CDRT8-shRNA重組質(zhì)粒為實驗組，以轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒為對照組。轉(zhuǎn)染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

收集轉(zhuǎn)染后48 h的兩組細(xì)胞，加入1 mL 70%乙醇固定，4 ℃下過夜，PBS溶液洗滌細(xì)胞，加入1 mL碘化丙啶染色液，4 ℃避光孵育30 min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。

1.6 MTT檢測

轉(zhuǎn)染48 h后，兩組細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，接種于96孔板。于接種后1、2、3、4、5 d分別進行MTT檢測，酶標(biāo)儀檢測每孔在波長490 nm處的吸光度(OD)。

1.7 集落形成實驗

轉(zhuǎn)染48 h后，兩組細(xì)胞分別制備單細(xì)胞懸液，以1 000個/孔接種于6孔板。培養(yǎng)10 d后，甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，統(tǒng)計集落形成數(shù)。

1.8 Western blot檢測

轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細(xì)胞，提取總蛋白，行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，封閉液封閉后在4 ℃下一抗孵育過夜，二抗孵育，ECL化學(xué)顯影劑發(fā)光顯影。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CDRT8在食管癌組織中的表達(dá)水平

qPCR檢測結(jié)果顯示，CDRT8在腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)水平分別為3.26±0.3和1.10±0.14。CDRT8在食管癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：與癌旁組織相比，**P<0.01

2.2 CDRT8在兩組TE-1細(xì)胞中的相對表達(dá)水平

以轉(zhuǎn)染CDRT8-shRNA重組質(zhì)粒為實驗組，以轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒為對照組。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TE-1細(xì)胞后，實驗組中CDRT8相對表達(dá)水平顯著低于對照組(0.29±0.05比1.09±0.29)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 CDRT8對食管癌TE-1細(xì)胞周期的影響

實驗組TE-1細(xì)胞中細(xì)胞周期在G0/G1期的占比明顯升高，細(xì)胞周期在S期和G2/M期的占比明顯降低，提示低表達(dá)CDRT8可抑制TE-1細(xì)胞周期的進展。見表1。

表1 CDRT8對食管癌細(xì)胞TE-1細(xì)胞周期的影響(%，)

注：與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

2.4 CDRT8對TE-1細(xì)胞活力的影響

自第4 天開始，與對照組相比，CDRT8-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的TE-1細(xì)胞的活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示CDRT8低表達(dá)能有效抑制TE-1細(xì)胞的活力，見圖2。

2.5 CDRT8對細(xì)胞增殖能力的影響

實驗組TE-1細(xì)胞的集落數(shù)目為(93.15±17.58)個，明顯低于對照組[(214.70±25.96)個]，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示CDRT8低表達(dá)能有效抑制TE-1細(xì)胞的增殖能力。

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.6 qPCR檢測YAP1 mRNA表達(dá)水平

實驗組TE-1細(xì)胞中YAP1 mRNA的表達(dá)水平為0.18±0.03，較對照組(1.15±0.34)顯著下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示CDRT8低表達(dá)可促進YAP1 mRNA的表達(dá)。

2.7 Western blot 結(jié)果

與對照組相比，實驗組TE-1細(xì)胞中YAP1、Cyclin E和CDK2蛋白表達(dá)水平顯著下降，提示CDRT8低表達(dá)可促進YAP1 mRNA的表達(dá)。見圖3。

圖3 兩組細(xì)胞中YAP1、Cyclin E和CDK2蛋白的表達(dá)情況

3 結(jié)論

繼微RNA(miRNA)之后，lncRNA極大豐富了機體中高度復(fù)雜的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[5]。lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，以往被誤判為基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，其是由大于200個核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA，在人類基因組中巨大的數(shù)量和多方面的機制調(diào)控越來越引起人們的重視[6]。lncRNA已經(jīng)成為多種疾病診斷、治療及預(yù)后評估的生物標(biāo)志物[7]。近年來研究表明，PEG10、POU3F3、CCAT2、PVT1等眾多l(xiāng)ncRNA參與食管癌的發(fā)生發(fā)展[8-11]。目前尚無CDRT8在人食管癌組織中的表達(dá)情況及其是否功能性參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展的公開報道。

本研究采用qPCR技術(shù)對人食管癌組織進行檢測，結(jié)果均表明CDRT8在食管癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，CDRT8可能在食管癌中發(fā)揮致癌作用。利用shRNA質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染技術(shù)可在短期內(nèi)大量降低細(xì)胞內(nèi)CDRT8的表達(dá)水平。本研究干擾細(xì)胞內(nèi)CDRT8的表達(dá)，在qPCR檢測結(jié)果證實細(xì)胞內(nèi)CDRT8含量降低后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明細(xì)胞周期停滯，MTT比色法和集落形成實驗結(jié)果均表明TE-1細(xì)胞的增殖和集落形成被顯著抑制，進一步證明CDRT8在人食管癌中發(fā)揮腫瘤促進因子的作用，參與調(diào)控食管癌的發(fā)生、發(fā)展。

YAP1是一種抑癌蛋白，在多種腫瘤中表現(xiàn)為高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)化[12]。有研究表明，YAP1 mRNA和蛋白在食管癌組織中明顯上調(diào)，且YAP1與食管癌的轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)[13-14]。本研究結(jié)果表明，抑制CDRT8表達(dá)后食管癌細(xì)胞中YAP1基因表達(dá)降低。YAP1可促進Cyclin E合成，Cyclin E結(jié)合并激活CDK2，Cyclin E-CDK2激酶復(fù)合物使細(xì)胞啟動DNA合成，不可逆轉(zhuǎn)地進入S期，增強細(xì)胞的增殖能力，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15-16]。抑制CDRT8表達(dá)后，食管癌細(xì)胞中Cyclin E和CDK2蛋白表達(dá)降低。CDRT8如何影響YAP1基因表達(dá)的分子機制尚未明確。lncRNA可作為分子海綿與miRNA結(jié)合進而抑制miRNA對下游相應(yīng)靶基因mRNA的沉默效應(yīng)。CDRT8可能通過與食管癌特異miRNA之間形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)，進而影響YAP1基因的表達(dá)，發(fā)揮致癌作用。

綜上所述，CDRT8在食管癌組織中呈高表達(dá)，干擾CDRT8的表達(dá)能顯著抑制食管癌細(xì)胞的增殖，其可能的機制是下調(diào)YAP1基因的表達(dá)，為lncRNA成為食管癌治療的新靶點提供了理論依據(jù)。