血管內皮生長因子-A和α-Adducin在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的相關性

胃癌(GC)是全球范圍內發病率和病死率較高的一種惡性腫瘤，近年來發病率逐年升高，患者呈年輕化趨勢[1-2]。淋巴結轉移是GC患者術后復發的主要因素之一，嚴重影響患者的預后。因此，對影響GC預后的相關因素分析具有重要的臨床意義。研究表明，血管內皮生長因子-A(VEGF-A)、細胞膜骨架蛋白α-Adducin(ADD1)在宮頸癌、原發性膽囊癌、食管鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中有異常表達，并與這些腫瘤的發生和侵襲轉移有關[3-5]。目前對于VEGF-A和ADD1在胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征及預后的相關性的研究較少。本研究通過檢測VEGF-A、ADD1在GC組織和癌旁正常組織中的表達水平，分析VEGF-A、ADD1在GC組織中的表達水平與臨床病理特征及預后的關系，并探討VEGF-A和ADD1之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2010年5月至2012年5月浙江省臺州醫院確診的147例GC患者的腫瘤組織，以及距腫瘤組織>1.5 cm的正常組織作為研究組和對照組。入選標準：(1)經病理學檢查確診為GC，腫瘤組織及癌旁正常組織為面積約2 cm×1.5 cm，厚度約0.3 cm的組織塊；(2)術前未經任何治療；(3)所有研究對象隨訪資料完整。排除標準：(1)合并有其他惡性腫瘤或其他嚴重疾病；(2)不能耐受本研究的治療；(3)依從性不佳，不能定期隨訪。本研究經本院倫理委員會批準。

147例患者中，男性123例，女性24例；年齡29～81歲，中位年齡為55歲，年齡≤55歲有70例，年齡>55歲有77例；腫瘤位置：上部61例，中部32例，下部51例，全胃3例；病理分化程度：中低分化113 例，高分化34例。所有患者及家屬對本研究充分知情，并簽署知情同意。

1.2 免疫組織化學方法

采用10%中性甲醛溶液(南京化學試劑股份有限公司)對所有標本進行固定，乙醇(武漢梯度科技有限公司)梯度脫水，用石蠟包埋成塊，切成4 μm連續切片，二甲苯(蘇州百騰科技有限公司)脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液(廣州威佳科技有限公司)抗原修復，PBS磷酸緩沖液(西安嘉博盈生物科技有限公司)漂洗，內源性過氧化物酶滅活，加山羊血清(上海恒遠生物科技有限公司)封閉，滴加稀釋比例為1∶200的兔抗人VEGF-A多克隆抗體(上海安妍生物科技有限公司)和稀釋比例為1∶300的兔抗人ADD1多克隆抗體(上海孟成科技有限公司)，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，滴加稀釋比例為1∶400的羊抗鼠IgG(廣州雷神生物科技有限公司)，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗，使用DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)進行顯色5 min，PBS終止反應，蘇木精(北京索萊寶科技有限公司)復染，脫水，中性樹脂封片劑(上海浩洋生物科技有限公司)封固，顯微鏡(成都英度科技有限公司)觀察VEGF-A、ADD1的表達。

1.3 判定標準

由兩名具有執業資格的病理科醫生采用雙盲法對結果進行判斷和分析，通過雙評半定量法對結果進行評定。染色強度：黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；陽性百分率：陽性細胞率≤5%計0分，陽性細胞率6%～25%計1分，陽性細胞率26%～50%計2分，陽性細胞率51%～75%計3分，陽性細胞率≥76%計4分。兩項評分之積為判定標準：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)[6-7]。本研究將陰性、弱陽性判定為低表達，陽性、強陽性判定為高表達。

1.4 隨訪方式

采用電話回訪和實地走訪相結合的方法定期隨訪，對患者術后的生活狀況進行記錄。術后第1天隨訪至2017年5月，前3年1個季度隨訪1次；第4～5年半年隨訪1次。隨訪內容包括臨床檢查、CT平掃、胃鏡檢查等。

1.5 觀察指標

觀察VEGF-A、ADD1在GC組織和癌旁正常組織中的表達水平，VEGF-A、ADD1表達水平與GC患者臨床病理參數的關系，VEGF-A、ADD1表達水平與患者預后的關系，VEGF-A、ADD1在GC組織表達的相關性。

1.6 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以率(%)表示，采用卡方檢驗；等級資料采用秩和檢驗，VEGF-A、ADD1高表達組和低表達組GC患者的總生存率(OS)、無病生存率(DFS)分析采用Kaplan-Meier生存分析法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF-A、ADD1在GC組織和癌旁正常組織中的表達水平

免疫組織化學染色結果顯示，VEGF-A主要定位于細胞漿，呈棕黃色顆粒；ADD1主要定位于細胞質，呈棕褐色顆粒(見圖1)。VEGF-A在GC組織和癌旁正常組織中的高表達率分別為49.66%(73/147)和13.61%(20/147)，GC組織中VEGF-A高表達率顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)；ADD1在GC組織和癌旁正常組織中高表達率分別為63.95%(94/147)和17.01%(25/147)，GC組織中ADD1高表達率顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)。見表1。

圖1VEGF-A、ADD1在GC組織和癌旁正常組織中的免疫組織化學染色AVEGF-A在GC組織中的陽性表達 ×200BVEGF-A在癌旁正常組織中的陰性表達 ×200CADD1在GC組織中的陽性表達 ×400DADD1在癌旁正常組織中的陰性表達 ×400

表1 VEGF-A、ADD1在GC組織和癌旁正常組織中的表達水平比較/例

注：“—”表示無數據

2.2 VEGF-A表達與GC患者各臨床病理參數之間的關系

在腫瘤位置不同的GC患者中VEGF-A表達水平差異有統計學意義(P<0.05)，而性別、淋巴結轉移、年齡、浸潤深度、組織分化程度、TNM分期不同的GC患者中VEGF-A表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 ADD1表達與GC患者各臨床病理參數之間的關系

組織分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移不同的GC患者中ADD1表達水平差異有統計學意義(P<0.05)，而性別、年齡、腫瘤位置不同的GC患者中ADD1表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 VEGF-A、ADD1在GC組織中的相關性分析

VEGF-A、ADD1在GC組織中的表達呈正相關(r=0.236，P=0.004)，見表4。

2.5 VEGF-A、ADD1高表達組和低表達組GC患者的OS、DFS的Kaplan-Meier分析

在147例GC患者中，VEGF-A高表達組OS及DFS顯著低于VEGF-A低表達組，差異有統計學意義(P<0.05)；ADD1高表達組OS及DFS顯著低于ADD1低表達組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、圖3。

表2 VEGF-A表達與GC患者各臨床病理參數之間的關系

表3 ADD1表達與GC患者各臨床病理參數之間的關系

表4 VEGF-A、ADD1在GC組織中的相關性分析/例

圖2 VEGF-A在GC患者中的生存分析ADFSBOS

3 討論

GC是發生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在中國其發病率居惡性腫瘤之首，臨床癥狀常表現為惡心、嘔吐、消瘦、上腹疼痛等，主要由環境、飲食習慣、細菌感染等因素所致[8-10]。GC的早期癥狀不明顯，治療方法單一，預后評估不良。因此，研究GC的發生發展機制對于GC的診斷和治療具有重要意義。

圖3 ADD1在GC患者中的生存分析ADFSBOS

血管生成是腫瘤發生、發展及轉移的基礎，由體內多種血管生成刺激因子和血管生成抑制因子共同調控，血管生成刺激因子主要包括血管生成素、血小板來源的內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、VEGF等。其中，VEGF作為單一基因編碼的同源二聚體糖蛋白，促血管生成的作用較強且特異性較高，其與內皮細胞上的兩種受體KDR、Flt-1結合后，可促進血管內皮細胞增殖，并誘導其遷移；同時還可提高血管通透性，引起纖維蛋白原等血漿蛋白外滲，并通過誘導間質產生而促進體內新生血管生成。VEGF-A是VEGF家族的重要成員，對腫瘤發生發展及血管生成具有重要作用。李華偉等[11]發現，VEGF-A在肝細胞癌中的表達明顯升高。王穎等[5]研究顯示，VEGF-A表達在研究食管鱗狀細胞癌(ESCC)淋巴結轉移方面具有一定的應用價值，可以作為評價預后的有效指標。本研究中，GC組織中VEGF-A高表達率顯著高于癌旁正常組織，提示VEGF-A參與GC的發生，這與李君強等[12]的研究結果一致。腫瘤位置不同的GC患者中VEGF-A表達水平差異顯著，而性別、淋巴結轉移、年齡、浸潤深度、組織分化程度、TNM分期不同的GC患者中VEGF-A表達水平差異不顯著，提示VEGF-A表達水平與腫瘤位置存在相關性，與性別、淋巴結轉移、年齡、浸潤深度、組織分化程度、TNM分期無相關性。對VEGF-A、ADD1兩者相關性分析顯示，VEGF-A與ADD1在GC組織中的表達呈正相關。生存率分析結果顯示，VEGF-A高表達組OS及DFS顯著低于VEGF-A低表達組，提示VEGF-A與GC預后有相關性。分析其原因，惡性腫瘤細胞增殖、分化及轉移需要大量營養元素，而人體內營養物質主要借助新生血管運輸至各個部位，因此當腫瘤發生時人體內重要的血管生成調節因子VEGF-A被激活，促進腫瘤進行增殖及遷移。

ADD1 是細胞膜骨架蛋白Adducin家族的重要成員，具有維持細胞膜穩定性及胞間信號轉導功能的作用。它不僅參與構建細胞膜骨架網狀結構，還參與細胞增殖、細胞膜離子轉運、細胞黏附等細胞的生命活動。ADD1 是一個由22個殘基組成MARCKS結構域的異源二聚體，位于MARCKS結構域中的磷酸化位點可被PKA、PKC、Src 蛋白激酶磷酸化，被磷酸化后的ADD1與肌動蛋白、血影蛋白之間的交互作用能力降低，使得細胞間黏附力減弱，導致細胞異常生長和分化。Kim等[13]發現，ADD1磷酸化與宮頸癌易感性相關。王夢菡等[14]發現，ADD1基因的磷酸化位點錯義突變rs4963可能是非賁門GC的遺傳易感因素。本研究結果顯示，GC組織中ADD1高表達率顯著高于癌旁正常組織，提示ADD1參與GC的發生，這與郭雄圖等[15]的研究結果相吻合。此外，本研究結果提示ADD1表達水平與組織分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移存在相關性，與性別、年齡、腫瘤位置無相關性。對VEGF-A、ADD1兩者相關性分析顯示，ADD1與VEGF-A在GC組織中的表達呈正相關，提示VEGF-A、ADD1在GC的發生發展過程中有著密切關系。生存率分析結果顯示，ADD1高表達組OS及DFS顯著低于ADD1低表達組，提示ADD1與GC預后有相關性。磷酸化是調控細胞生命活動的重要手段，可改變蛋白質活性，也可影響細胞增殖、分化及凋亡，由于ADD1可被多種蛋白激酶磷酸化，被磷酸化后的 ADD1失去正常調控功能，從而導致細胞惡性增殖。

綜上所述，VEGF-A、ADD1在GC組織中呈高表達，VEGF-A表達水平與GC患者腫瘤位置及GC預后呈相關性，ADD1表達水平與GC患者組織分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移及GC預后呈相關性，且VEGF-A與ADD1在GC組織中的表達呈正相關。但本研究存在一定局限性，如指標觀察的半定量性質、取材的局限性、納入病例數較少、研究時間較短等，仍需今后進一步深入研究。