丙硫氧嘧啶聯合丹梔復方治療甲狀腺功能亢進合并妊娠小鼠對其子代甲狀腺功能的影響

包春燕， 周林裕， 于曉霞， 李彩霞

（西安交通大學醫學院附屬3201醫院，陜西漢中 723000）

甲狀腺功能亢進（以下簡稱“甲亢”）是臨床上較為常見的一種疾病，發病率較高。其病因主要是由于機體甲狀腺激素分泌過多，引起機體自身代謝升高。甲亢為特異性自身免疫性疾病，女性發病率更高[1-3]。甲亢是妊娠期女性常患的疾病，會對子代造成不良影響，如出現新生兒體質量偏小、甲狀腺功能異常，甚至會出現早產、流產、死胎、畸形等情況。甲亢臨床表現有高代謝癥候、眼突出、彌漫性甲狀腺腫等。目前尚無研究確切地闡述其發病機理，其治療主要依靠抗甲狀腺藥物治療和手術治療[4]?？辜谞钕偎幬锏淖饔每赡?，不損害甲狀腺濾泡結構，也不造成永久性甲狀腺功能減退。丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）作為一種常見的抗甲狀腺藥物，通過減少血液中T4向T3的轉化，有效控制母體的甲狀腺激素含量，達到治療效果[5]，但其對胎兒的影響尚缺乏相關的研究和結論。另外，大量臨床研究表明，中醫藥復方制劑可有效緩解甲亢患者的臨床癥狀。為探究PTU及聯合中藥制劑（選擇自擬丹梔復方）治療甲亢后對胎兒的影響，本研究以小鼠為研究對象，觀察其療效及對子代小鼠甲狀腺功能的調節作用，以期為臨床治療提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級C57/BL6雌性小鼠150只，體質量（19.11±1.36）g，鼠齡8周；SPF級C57/BL6雄性小鼠50只，體質量（20.14±1.55）g，鼠齡8周。均由湖北省疾病控制中心提供，生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。養殖環境溫度為（25.0±1.0）℃，濕度為70%～85%。所有小鼠狀態良好，精神狀態穩定，無撕咬、爭斗、攻擊行為。本研究中動物實驗經西安交通大學醫學院動物倫理委員會同意，所有操作符合標準。

1.2 藥物與制備 丹梔復方組成：牡丹皮15 g，梔子12 g，柴胡12 g，蒼術12 g，地骨皮12 g，白芍10 g，當歸10 g，白術10 g，生姜5 g，甘草6 g，柏子仁15 g，薄荷8 g，麥冬15 g，鉤藤12 g，酸棗仁16 g。各中藥材均購自西安交通大學醫學院附屬3201醫院藥房。將上述中藥材加500 mL蒸餾水，文火煎煮，取汁150 mL，備用[6]。按照人與動物間體表面積等效表[7]換算出小鼠丹梔復方劑量為11.0 g·kg-1·d-1（設定人的體質量為70 kg，體表面積單位質量用藥量的折算系數為9.1）。丙硫氧嘧啶片購自西安交通大學醫學院附屬3201醫院藥房。

1.3 試劑與儀器 Ad-TSHR289/6xHis腺病毒，購自上海吉瑪生物公司（中國），由公司定制，無產品型號；總三碘甲狀腺原氨酸（TT3）、總甲狀腺素（TT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，FT4）測定試劑盒購自南京建成生物公司（中國），序號分別為H224、H225、H222、H223；60 000 cpm 的125I-反三碘甲狀腺原氨酸（rT3），60 000 cpm的125I-T4，160 000 cpm的125I-T3，質量濃度為10 μg/mL的T3標準品2 mL，濃度為10 μg/mL的T4標準品2 mL，質量濃度為10 μg/mL的rT3標準品2 mL均購于北京北方生物技術研究所（中國），定制產品，無產品型號。Multiskan酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；Aquaplore 3超級純水儀（美國艾科浦國際有限公司）；BSA423S電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；5424R離心機（德國Eppendorf公司）。

1.4 造模 實驗小鼠適應7 d后，隨機抽取120只雌性小鼠進行造模處理，剩下30只雌性小鼠設為正常組。于小鼠腿部注射腺病毒Ad-TSHR289/6xHis（滴度為1×1010顆粒/50 μL）免疫建立甲亢模型，每3周免疫1次，總共免疫3次。判斷甲亢模型造模成功的標準為：FT4和FT3水平顯著増高，甲狀腺組織有彌漫性甲狀腺腫伴或不伴促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）降低[6]。故檢測各組小鼠造模前后的FT4、FT3水平，以判斷造模成功與否。

1.5 分組與給藥 將造模成功的雌性小鼠分為4組：空白組，模型組，PTU組，PTU+丹梔復方組。各組分別與正常同齡雄性小鼠按雌雄比2∶1合籠配對，經過2次合籠，每次合籠時間為2 d，剔除11只未受孕的雌性小鼠。發現雌鼠陰道栓則視為妊娠第1天，繼續飼養并分別給PTU組、PTU+丹梔復方組灌胃PTU懸濁液4.0 mg·kg-1·d-1、丹梔復方11.0 g·kg-1·d-1+PTU 4.0 mg·kg-1·d-1。從受孕成功開始持續給藥16 d，觀察直至分娩，分娩后母乳喂養，獲得分娩后3周的母鼠和子鼠。模型組、空白組小鼠灌胃等量生理鹽水，采用同樣的方法和飼養環境獲得母鼠和子鼠。觀察子鼠的基本情況，統計不良妊娠發生率（=不良妊娠/總親本數）。流產、早產、死胎等非正常分娩行為則被判定為不良妊娠發生。雄性小鼠在配對前血清中FT3和FT4平均水平分別為（5.18±1.03）fg/mL和（18.86±5.14）fg/mL。

1.6 酶聯免疫吸附分析（ELISA）檢測小鼠甲狀腺激素水平 小鼠分娩后，于3周齡時空腹24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg體質量）麻醉小鼠。摘眼球采集血液，抗凝靜置2 h后，以3 000 r/min的速度離心15 min。取上清液，采用ELISA法檢測甲狀腺激素 TT3、TT4、FT3、FT4的水平。根據 TT3、TT4、FT3、FT4試劑盒說明書稀釋濃度梯度標準品，繪制標準曲線。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40 μL，然后再加生物素標記的抗體10 μL。將樣品加于酶標板孔底部。每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔不加。封板室溫靜置30 min。將濃縮洗滌液用蒸餾水后備用。去封板膜，棄液體，每孔以上述洗滌液重復洗滌5次，加入顯色液，37℃避光顯色10 min，加終止液50 μL，終止反應。用酶標儀讀取吸光度后，根據標準曲線計算TT3、TT4、FT3、FT4的質量濃度。

1.7 采用放射免疫法測量脫碘酶的活性 取小鼠肝臟，加入1 mL緩沖液（0.01 mol/L的PBS，1 mmol/LDTT，2mmol/LEDTA，pH=7），4℃10000 r/min速度離心20 min，取上清液用Bradford蛋白測定法定量蛋白含量；分別以125I-rT3、125I-T4、125I-T3為底物，根據免疫反應，測定上清液中的Ⅰ型脫碘酶（ID1）、Ⅱ型脫碘酶（ID2）、Ⅲ型脫碘酶（ID3）的活性。

1.8 統計方法 應用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(-x±s)表示，多組比較采用多因素方差分析法，2組比較采用t檢驗，百分比數據采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模前后雌性親本小鼠FT3、FT4水平比較 表1結果顯示：造模前，造模組小鼠甲狀腺激素FT3、FT4水平與正常組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；造模后，造模組小鼠FT3、FT4水平均較造模前升高，且顯著高于正常組（P＜0.05）。表明造模成功。

2.2 各組母鼠不良妊娠發生率、子鼠體質量比較 表2結果顯示：空白組無不良妊娠發生。模型組發生8例不良妊娠，不良妊娠發生率為33.33%。與空白組比較，模型組母鼠不良妊娠發生率升高，子鼠體質量降低（均P＜0.05）；與模型組比較，PTU組和PTU+丹桅復方組母鼠不良妊娠發生率降低，子鼠體質量升高（均P＜0.05），且PTU+丹桅復方組對其改善作用優于PTU組。

表1 造模前后雌性親本小鼠FT3、FT4水平比較Table 1 Comparison of the levels of FT3and FT4 in the of female parent mice before and after modeling[-x±s，ρ/（fg·mL-1）]

表2 各組母鼠不良妊娠發生率、子鼠體質量比較Table 2 Comparison of the rate of abnormal pregnancy in female mice and the body mass of offspring mice in various groups

2.3 各組子鼠甲狀腺激素水平比較 表3結果顯示：與空白組比較，模型組子鼠血清TT3、TT4、FT3、FT4含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，PTU組和PTU+丹梔復方組子鼠的TT3、TT4、FT3、FT4水平均顯著降低（P ＜ 0.05），且PTU+丹梔復方組對子鼠TT3、TT4、FT3、FT4水平的降低作用優于PTU組（P＜0.05）。

2.4 各組子鼠脫碘酶活性比較 表4結果結果顯示：與空白組比較，模型組子鼠ID1、ID2水平均顯著升高，ID3水平顯著降低（均P＜0.05）；與模型組比較，PTU組和PTU+丹梔復方組子鼠ID1、ID2水平均顯著降低，ID3水平顯著升高（均P＜0.05），且PTU+丹梔復方組對子鼠ID1、ID2、ID3的改善作用優于PTU組（P＜0.05）。

表3 各組子鼠血清TT3、TT4、FT3、FT4含量比較Table 3 Comparison of the serum contents of TT3，TT4，FT3and FT4 in the offspring mice in various groups (-x±s)

表4 各組子鼠脫碘酶活性比較（-x±s）Table 4 Comparison of the activity of deiodinases in the offspring mice in various groups[（pmoL125I/mg protein-1·min-1）

3 討論

甲狀腺是機體最重要的腺體之一，妊娠期的大量生理活動都和甲狀腺激素的調控息息相關。甲狀腺激素有三碘甲狀腺原氨酸（T3）和甲狀腺素（T4）2種主要形式，機體中的甲狀腺激素多以T4的形式貯存，而T3量雖然較少，生物活性卻比T4強得多[8]。當機體缺少甲狀腺激素時，體內貯存的T4則通過脫碘酶的作用將T4轉化為活性更強的T3。T4可以經過ID1和ID2的外環脫碘，形成T3，或者由ID1或者ID3的內環脫碘后，轉化成不具有生物活性的反3，3’，5’-三碘甲狀腺原氨酸（rT3），最終由ID1或ID2多次催化脫碘，形成不含碘的物質，代謝出機體外。ID1是唯一一種既可以催化內環脫碘，又可以外環脫碘的酶，是機體中催化T4向T3轉化的主要脫碘酶，這種途徑也是機體保證T3含量的主要來源[9-11]。機體內甲狀腺激素水平和脫碘酶的含量指示了甲狀腺功能的狀態。3種脫碘酶在機體中共同調整甲狀腺激素的相互轉化，保持機體的甲狀腺激素水平平衡。PTU治療甲亢的主要機制是通過阻止T4向T3轉化，實現減弱具有生物活性的甲狀腺激素含量[4]。

在本研究中，妊娠小鼠采用PTU聯合丹梔復方治療，可糾正甲狀腺功能過于活躍的現象，顯著降低妊娠小鼠的甲狀腺激素水平，且子代小鼠發育正常。同時，PTU+丹梔復方組的子代小鼠ID1、ID2含量顯著降低，ID3活性顯著升高。提示PTU聯合丹梔復方治療妊娠小鼠，不僅降低妊娠小鼠的甲狀腺激素水平，而且加速甲狀腺激素的代謝，保持正常的甲狀腺激素水平，并顯著降低了不良妊娠的發生率。但其藥理還需要進一步研究。綜上所述，PTU聯合丹梔復方治療妊娠合并甲亢的小鼠有顯著效果，對子代小鼠的甲狀腺激素水平有重要調節作用，使子代小鼠甲狀腺水平趨于正常水平，顯著降低子代的不良妊娠發生率。