不同慢性阻塞性肺疾病全球倡議分級慢性阻塞性肺疾病穩定期患者外周血輔助性T細胞17、調節性T細胞含量的對比分析

金晶 ，王晶 ，荊晶 ，李風森

長期氣道慢性炎癥持續狀態是導致慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者急性加重的主要原因［1］，近年來輔助性T細胞17（T helper 17 cells，Th17）/調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）失衡所致免疫應答反應過度或免疫抑制作用過強在COPD發病機制中的作用逐漸受到關注［2-3］。Th17與Treg共同維持機體免疫平衡，其中Th17可在一定程度上評估COPD患者病情嚴重程度及預后［4］，而Treg可反映有害氣體或顆粒等所致氣道炎癥嚴重程度，并具有一定抑制炎癥作用［5］。本研究旨在對比不同慢性阻塞性肺疾病全球倡議（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）分級［6］COPD 穩定期患者外周血Th17、Treg含量，以期為臨床有效治療COPD穩定期患者提供新的靶點，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年6—12月于新疆醫科大學附屬中醫醫院接受門診隨訪的COPD穩定期患者96例，年齡45～80歲，均符合2013版GOLD中的COPD穩定期診斷標準［6］，排除標準：（1）伴有氣胸、胸腔積液、活動性肺結核等其他肺部疾病者；（2）伴有嚴重心、腦血管疾病，肝、腎功能不全，造血系統疾病等者；（3）伴有精神異常者；（4）妊娠期或哺乳期婦女；（5）伴有惡性腫瘤者；（6）存在先天或后天性免疫缺陷者。參照2013版GOLD分級標準將所有患者分為B級組40例、C級組23例、D級組33例；另選取同期于新疆醫科大學附屬中醫醫院體檢中心體檢且年齡匹配的健康者30例作為對照組。本研究經新疆醫科大學附屬中醫醫院醫學倫理委員會審核批準（審批號：20170214-116），4組受試者對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 2013 版GOLD分級標準 2013版GOLD分級標準涉及肺功能、慢性阻塞性肺疾病評估測試（COPD Assessment Test，CAT）評分、入組前12個月內急性加重次數及住院次數4項，以癥狀少病情輕為A級，癥狀多病情輕為B級，癥狀少病情重為C級，癥狀多病情重為D級。

1.3 儀器及試劑 流式細胞檢測儀（guava easy Cyte8HT，MILLIPORE公司生產，中國），Multiskan Spectrum全波長酶標儀（德國 Thermo Fisher公司生產），流式上樣管（12 mm×75 mm，5 ml，Falcon）；Treg抗 體：CD4（ 美國BD公司生產，生產批號：555346），CD25（美國BD公司生產，生產批號：555434），CD127（美國BD公司生產，生產批號：557938）；Th17抗體：CD4（美國BD公司生產，生產批號：555346），CD183（美國BD公司生產，生產批號：550967），CD196（美國BD公司生產，生產批號：559562）；人白介素17a（IL-17a）、白介素10（IL-10）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司生產，生產批號：96T48TCY40067、96T48TCY40062）。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般資料 比較4組受試者性別、年齡、身高、體質量。

1.4.2 外周血IL-17a、IL-10水平 采集4組受試者外周血5 ml，3 000 r/min（離心半徑3 cm）離心10 min，采用EP管留取血清并保存于-80 ℃冰箱；采用ELISA雙抗夾心法檢測外周血IL-17a、IL-10水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 外周血Th17、Treg含量及Th17/Treg比值 采集4組受試者外周血2 ml，加入100 μl肝素鈉抗凝，Th17的檢測依次加入表面標記抗體CD4 FITC 20 μl、CD3 PCP5.5 5 μl、CD183 APC 20 μl、CD196 PE 5 μl，混勻；Treg的檢測依次加入表面標記抗體 CD4 FITC 20 μl、CD25 APC 20 μl、CD127 PE 5 μl、CD4 FITC 20 μl、CD3 PCP5.5 5 μl、CD183 APC 20 μl、CD196 PE 5 μl，混勻；避光孵育30 min后加入溶血素裂解紅細胞，300×g離心5 min，棄上清并加入磷酸鹽緩沖液（PBS）2 ml，300×g離心5 min，棄上清并加入PBS 500 μl，混勻后上機檢測，將測得的數據存盤后采用CELL Quest軟件進行分析，并計算Th17/Treg比值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行數據分析，年齡、身高、體質量、外周血IL-10及IL-17a水平、外周血Th17及Treg含量、Th17/Treg比值均符合正態分布，以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗；性別以相對數表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 4組受試者性別、年齡、身高比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。4組受試者體質量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；B級組、C級組、D級組患者體質量小于對照組，C級組、D級組患者體質量小于B級組，D級組患者體質量小于C級組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 4組受試者一般資料比較Table 1 Comparison of general information in the four groups

2.2 外周血IL-17a、IL-10水平 4組受試者外周血IL-17a、IL-10水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；B級組、C級組、D級組患者外周血IL-17a水平高于對照組，C級組、D級組患者外周血IL-17a水平高于B級組，D級組患者外周血IL-17a水平高于C級組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B級組、C級組、D級組患者外周血IL-10水平低于對照組，C級組、D級組患者外周血IL-10水平低于B級組，D級組患者外周血IL-10水平低于C級組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 4組受試者外周血IL-17a、IL-10水平比較（±s，ng/L）Table 2 Comparison of peripheral blood IL-17a and IL-10 levels in the four groups

表2 4組受試者外周血IL-17a、IL-10水平比較（±s，ng/L）Table 2 Comparison of peripheral blood IL-17a and IL-10 levels in the four groups

注：IL-17a=白介素17a，IL-10=白介素10；與對照組比較，aP＜0.05；與B級組比較，bP＜0.05；與C級組比較，cP＜0.05

組別 例數 IL-17a IL-10對照組 30 18.46±5.17 14.87±1.39 B級組 40 105.77±55.79a 11.85±1.31a C級組 23 154.80±60.53ab 7.73±0.84ab D級組 33 190.19±94.17abc 3.65±0.68abc F值 20.597 10.916 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.3 外周血Th17、Treg含量及Th17/Treg比值 4組受試者外周血Th17、Treg含量及Th17/Treg比值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；B級組、C級組、D級組患者外周血Th17含量及Th17/Treg比值高于對照組，C級組、D級組患者外周血Th17含量及Th17/Treg比值高于B級組，D級組患者外周血Th17含量及Th17/Treg比值高于C級組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B級組、C級組、D級組患者外周血Treg含量低于對照組，C級組、D級組患者外周血Treg含量低于B級組，D級組患者外周血Treg含量低于C級組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 4組受試者外周血Th17、Treg含量及Th17/Treg比值比較（±s）Table 3 Comparison of peripheral blood Th17 and Treg contents，and Th17/Treg ratio in the four groups

表3 4組受試者外周血Th17、Treg含量及Th17/Treg比值比較（±s）Table 3 Comparison of peripheral blood Th17 and Treg contents，and Th17/Treg ratio in the four groups

注：Th17=輔助性T細胞17，Treg=調節性T細胞；與對照組比較，aP＜0.05；與B級組比較，bP＜0.05；與C級組比較，cP＜0.05

組別 例數 Th17（%） Treg（%） Th17/Treg比值對照組 30 13.74±5.82 17.85±5.52 1.07±0.65 B 級組 40 26.97±13.30a 13.69±5.47a 3.47±0.83a C 級組 23 33.25±13.90ab 7.55±4.87ab 5.90±1.16ab D 級組 33 53.47±5.82abc 3.31±4.63abc 9.71±1.59abc F值 20.550 11.020 9.878 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

近年來，炎癥/免疫機制在COPD發病機制中的作用備受關注［7-8］，Th17、Treg均屬 CD4+T淋巴細胞亞群，二者分化過程及功能相互對抗，生理條件下保持著動態平衡，有利于維持機體免疫狀態穩定，在免疫應答及免疫抑制方面具有重要作用［9］。中醫辨證論治體系認為，疾病的發生與陰陽失衡有關，需通過“調和陰陽”而達到“陰平陽秘，邪不可干”的治療疾病目的［10］，Th17與Treg的關系猶如中醫學陰陽關系，此消彼長、協調平衡［11］。

本研究結果顯示，B級組、C級組、D級組患者體質量小于對照組，C級組、D級組患者體質量小于B級組，D級組患者體質量小于C級組，提示COPD穩定期患者體質量較低，且隨著GOLD分級增加，COPD穩定期患者體質量逐漸降低，提示體質量可能與COPD穩定期患者病情嚴重程度有關［12］；但由于COPD穩定期患者長期慢性炎癥不僅局限于肺組織，還常伴有全身系統性炎癥，因此不能排除全身系統性炎癥所致COPD患者體質量降低。

研究表明，炎性反應和免疫功能紊亂在COPD發生、發展過程中具有重要作用［13］。本研究結果顯示，B級組、C級組、D級組患者外周血IL-17a水平、Th17含量及Th17/Treg比值高于對照組，C級組、D級組患者外周血IL-17a水平、Th17含量及Th17/Treg比值高于B級組，D級組患者外周血IL-17a水平、Th17含量及Th17/Treg比值高于C級組，而B級組、C級組、D級組患者外周血IL-10水平、Treg含量低于對照組，C級組、D級組患者外周血IL-10水平、Treg含量低于B級組，D級組患者外周血IL-10水平、Treg含量低于C級組，提示COPD穩定期患者存在炎性反應、免疫功能紊亂，且隨著GOLD分級增加，COPD穩定期患者炎性反應、免疫功能紊亂程度逐漸加重，分析其可能原因為：Th17可通過IL-17a而促進免疫應答并促使中性粒細胞聚集、活化及分泌多種炎性因子，而Treg介導免疫抑制，可通過釋放IL-10而抑制T細胞及抗原呈遞細胞功能，Th17/Treg失衡可導致促炎性因子分泌增多及機體抑制炎性反應作用不足，繼而加重COPD患者炎性反應及病情嚴重程度［14-16］。

綜上所述，隨著GOLD分級增加，COPD穩定期患者外周血Th17含量逐漸升高、Treg含量逐漸降低，炎性反應、免疫功能紊亂程度逐漸加重，而有效控制Th17/Treg失衡、升高Treg含量對于改善COPD穩定期患者病情嚴重程度可能具有重要意義，并有可能成為中醫宏觀、西醫微觀防治穩定期COPD的新靶點。