復發性腦膠質瘤患者磷脂酰乙醇胺結合蛋白4表達情況及其臨床意義研究

張濤，王輝，楊曉文，胡鈞濤，汪超甲，李安榮，周一

腦膠質瘤的臨床特征、組織及基因均具有異質性，也是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤。腦膠質瘤的預后較差，5年生存者較少超過10%［1-3］。腦膠質瘤首選手術治療，但因其具有侵襲性，無法將病灶完全切除，使術后復發率達100%［4-5］。復發的腦膠質瘤會隨著病情程度加重，其侵襲等生物學表現也加重，即便經綜合治療后病情也不斷進展，導致了極高的病死率［6-7］。近年來隨著分子生物學研究不斷深入，腦膠質瘤也開始從分子病理學展開研究［8］。磷脂酰乙醇胺結合蛋白4（PEBP4）是一個結構上高度保守的胞質可溶性蛋白，可參與調節G蛋白耦聯受體通路、ERK通路、核因子κB（NF-κB）通路等多種重要信號通路轉導［9］，在多種惡性腫瘤侵襲、增殖過程中發揮著重要作用［10］。研究表明，PEBP4對前列腺癌等腫瘤的侵襲、遷移具有促進作用，且與部分腫瘤患者生存時間呈負相關［11］，但其與復發性腦膠質瘤的關系研究報道較為少見。本研究旨在分析復發性腦膠質瘤患者PEBP4表達情況及其臨床意義，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年8月—2017年12月十堰市太和醫院收治的復發性腦膠質瘤患者40例，均符合復發性腦膠質瘤的診斷標準［1-2］，且經歷兩次手術。另選取本院同期收治的因腦出血或腦創傷而行顱內減壓術的患者40例。納入標準：（1）臨床資料完整者；（2）年齡20～80歲；（3）術前經化療、放療等免疫性治療者。排除標準：（1）妊娠期與哺乳期婦女；（2）合并其他顱內病變者。本研究經十堰市太和醫院醫學倫理委員會審核批準，患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法 所有患者在無菌環境中提取術后得到的復發性腦膠質瘤標本（復發性腦膠質瘤患者）與正常腦組織標本（腦出血或腦創傷患者），使用0.9%氯化鈉溶液沖洗壞死組織、血塊與電灼部分組織，并將每個標本分成兩部分，其中一部分置于10%福爾馬林液中浸泡，另一部分則放于5 ml EP凍存管并置于-80 ℃液氮中速凍。

1.2.1 聚合酶鏈反應（PCR） 采用PCR檢測復發性腦膠質瘤標本與正常腦組織標本PEBP4 mRNA相對表達量，上游引物序列：5'-TCGGCCAGTGGAACTACACCT-3'，下游引物序列：5'-TCCACCAAGAGCCAAGAGGATAGA-3'。β-actin內參引物設計，上游引物序列：5'-CCTAGAAGCAnrTG CGGTGCACGATG-3'，下游引物序列：5'-TCATGAAG TGTGACGTrGACATCCGT-3'。

1.2.2 Western blot法 采用Western blot法檢測復發性腦膠質瘤標本與正常腦組織標本PEBP4蛋白相對表達量：研磨復發性腦膠質瘤標本與正常腦組織標本，3 000 r/min離心30 min（離心半徑10 cm）后棄沉淀，采用考馬斯亮藍法檢測上清液中蛋白濃度；以聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，封閉1 h，加入山羊抗PEBP4多克隆抗體（1:1 000）、兔抗β-actin多克隆抗體（1:5 000）并置于4 ℃環境中保存過夜，TBST洗滌后采用化學發光試劑進行自顯影。

1.2.3 免疫組化分析 對復發性腦膠質瘤標本與正常腦組織標本實施包埋，以4 μm的厚度進行切片并封存于山羊血清中，于室溫下等待5 min，滴加（1:200）PEBP4一抗，置于4 ℃環境下12 h。PBS洗滌后采用室溫孵育30 min，再次使用PBS清洗，采取二氨基聯苯胺法進行染色；采用高倍顯微鏡隨機選擇5個視野進行觀察，同時每個視野觀察的腫瘤細胞為100個。根據陽性細胞染色強度以及染色陽性細胞數進行評分，陽性細胞率為0～5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，＞50%記3分；細胞不著色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；將上述得分相加，0～1分為（-），2～5分為（+），6～8分為（++），9分為（+++）。陽性信號標準為棕黃色或黃色，其中（+）、（++）、（+++）為PEBP4陽性表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.00統計軟件進行數據分析，計數資料分析采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準（雙側）α=0.05。

2 結果

2.1 PEBP4 mRNA及蛋白相對表達量 復發性腦膠質瘤標本PEBP4 mRNA相對表達量為（8.24±1.56），高于正常腦組織標本的（1.87±0.22），差異有統計學意義（t=22.842，P＜0.01）。復發性腦膠質瘤標本PEBP4蛋白相對表達量為（9.28±1.22），高于正常腦組織標本的（1.83±1.32），差異有統計學意義（t=28.924，P＜0.01）。正常腦組織標本及不同臨床分級復發性腦膠質瘤標本PEBP4電泳結果見圖1。

2.2 PEBP4免疫組化結果 PEBP4陽性呈黃色、棕黃色顆粒狀，主要見于胞膜或胞質。復發性腦膠質瘤標本PEBP4陽性表達率為80.0%，高于正常腦組織標本的20.0%，差異有統計學意義（χ2=28.800，P＜0.05，見圖2）。

2.3 復發性腦膠質瘤標本PEBP4陽性表達的相關因素 不同性別、年齡、腫瘤直徑復發性腦膠質瘤標本PEBP4陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同臨床分級、KPS評分、分化程度復發性腦膠質瘤標本PEBP4陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

3 討論

腦膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，由于其具有高侵襲性常導致臨床治療較困難，且患者的預后較差［12-13］。腦膠質瘤各個分級的生物學行為均具有惡性表現，雖然手術治療有一定效果，但因腫瘤組織和正常腦組織間界限不明顯而使腫瘤清除不徹底，導致極高的復發率［14-16］。目前醫學界普遍認為，腦膠質瘤發生及復發過程是多因素、多基因共同參與的生物學過程［17-18］。復發性腦膠質瘤患者平均生存時間為15個月左右，傳統化療靶點缺乏特異性，無法分辨正常腦組織和腫瘤組織，易產生治療耐藥性［19-20］。

圖1 正常腦組織標本及不同臨床分級復發性腦膠質瘤標本PEBP4電泳結果Figure 1 Electrophoretogram of PEBP4 in normal brain tissue specimens and recurrent glioma specimens with different clinical classification

圖2 復發性腦膠質瘤及正常腦組織標本染色結果（二氨基聯苯胺染色，×400）Figure 2 Coloration results of recurrent glioma specimens and normal brain tissue specimens

表1 復發性腦膠質瘤標本PEBP4陽性表達的相關因素〔n（%）〕Table 1 Related factors of positive expression of PEBP4 in recurrent glioma specimens

PEBP4作為具有磷脂酰乙醇胺（PE）結合能力的堿性家族蛋白，其分子量為21～23 kDa，在多種腫瘤組織中的陽性檢出率均較高。通過對骨髓基質細胞cDNA數據庫進行分離及大規模篩選發現，PEBP4主要編碼在901bp中，mRNA序列大多存在于染色體8p21.3上，其可通過激活ERK信號通路而抑制腫瘤壞死因子α的誘導細胞凋亡，進而在人體代謝中發揮重要的作用。PEBP結構與PE、核苷酸類、其他疏水配體有著較高親和力，且可分不同亞型，其中PEBP4、RKIP、MRPL38亞型在總體上結構相似，主要區別于N-末端片段序列［21］。植物類PEBP其同源結構能夠控制枝條生長、花朵結構形態，哺乳動物體內PEBP能提高膽堿乙酰轉移酶的合成，參與調節多種疾病的發生發展。有研究發現，高PEBP4能夠激活血管內皮生長因子等諸多因子，提高細胞運動性，促進血管生成，且對惡性腫瘤浸潤有一定作用［22-23］。PEBP4生理功能主要是與PE結合構成細胞膜，可維持胞膜流動性及功能結構的形成［24］。本研究結果顯示，復發性腦膠質瘤標本PEBP4 mRNA及蛋白相對表達量高于正常腦組織標本，表明復發性腦膠質瘤患者PEBP4呈高表達，分析其可能機制為高PEBP4可減弱蛋白酶體對磷酸化雌激素受體的降解作用并增強其增殖功能、抑制JNK信號通路、激活AKT信號通路，繼而通過影響JNK信號通路而發揮促腫瘤生長作用并維持上皮分化功能，最終導致腦膠質瘤復發［25］。

既往研究表明，直腸癌中PEBP4蛋白相對表達量升高與腫瘤轉移、侵襲等相關，并與患者放療耐受、生存期呈正相關［26］；PEBP4高表達與腦膠質瘤WHO分級有關，而高表達PEBP4的腦膠質瘤患者病死率較高［27］。本研究結果顯示，不同臨床分級、KPS評分、分化程度復發性腦膠質瘤標本PEBP4陽性表達率有統計學差異，提示PEBP4表達可能與復發性腦膠質瘤患者臨床分級、KPS評分、分化程度有關。

綜上所述，復發性腦膠質瘤患者PEBP4呈高表達，其表達可能與臨床分級、KPS評分、分化程度有關，有可能成為判斷復發性腦膠質瘤的重要標志物；但本研究樣本量較小且為單中心研究，相關因素的納入尚不夠全面，存在一定選擇偏倚，結果結論仍有待進一步研究證實。