Myh13敲除小鼠表型的初步分析

何一旻, 顧鳴敏

(上海交通大學醫學院醫學遺傳學實驗室, 上海 200025)

肌球蛋白超家族(myosin superfamily)是一類高度保守且廣泛存在于真核細胞中的家族蛋白，通過水解三磷酸腺苷(ATP)，將化學能轉化為機械能，在胞質流動、物質運輸和肌肉收縮等多種生理活動中發揮重要的作用。在該蛋白家族中, 肌球蛋白II類是橫紋肌、平滑肌和非肌細胞中肌絲的重要組成成分[1]。肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MyHC)是肌球蛋白II類分子的關鍵亞基。迄今為止，在哺乳動物中已發現約13種MyHC亞型，分別由MYH家族基因不同成員編碼。其中，編碼骨骼肌MyHC亞型的有6種，MYH13基因為其中之一[2]。

小鼠Myh13基因定位于第11號染色體，由39個外顯子組成, 開放閱讀框全長5 817 bp，編碼產物為MyHC-eo亞型, 由1933個氨基酸組成。MyHC-eo蛋白序列在不同種屬之間高度保守，經比對，小鼠的MyHC-eo蛋白序列與人MyHC-eo蛋白序列相似度約為96%。在生理狀態下, MyHC-eo與其他MyHC亞型一樣，由2條MyHC和2對不同的輕鏈組成一個完整的肌球蛋白分子。MyHC蛋白包含2個關鍵的結構域： N端的頭部結構域，含肌動蛋白和ATP結合位點，即所謂的橫橋; C端的桿狀結構域，參與粗肌絲的形成[3]。

在人類中，MyHC-eo特異性高表達于眼外肌(extraocular muscle, EOM)纖維中[4]，為一類具有超高速率、低張力、耐疲勞特點的肌纖維[5]。體外研究[6]結果表明, 在橫橋周期動態變化過程中, 與其他骨骼肌中的MyHC IIa、MyHC IIb和MyHC IIx亞型相比, MyHC-eo結合肌動蛋白后與二磷酸腺苷(ADP)的親和力最低，與肌動蛋白的結合和解離速率最快，橫橋周期最短，導致肌肉收縮超快。然而，迄今為止，仍缺乏解釋MyHC-eo與眼外肌超高速率、低張力、耐疲勞特點相關的體內實驗依據，更不清楚MYH13在眼外肌纖維中所發揮的生物學作用。

本研究首先分析了Myh13在小鼠中的表達情況，證明在小鼠中Myh13同樣特異性高表達于眼外肌中。隨后，對Myh13敲除小鼠進行表型初步分析。結果顯示，Myh13的敲除對小鼠的生長發育、基礎代謝等沒有明顯影響，但會引起小鼠眼外肌纖維微觀結構的改變，為后續研究MYH13在眼外肌中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術建立的Myh13敲除小鼠，該工作由上海南方模式生物科技有限公司完成，所用小鼠品系為C57BL/6J[SCXK(滬)2017-0010]。所得小鼠后續均飼養于SPF環境中，該環境維持恒溫(21～22 ℃)恒濕(55%～65%)，光照明暗交替12 h/d[SYXK(滬)2017-0012]。

1.2 主要儀器與試劑

基因組DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶、動物組織總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒Quantscript RT試劑盒、qPCR試劑盒SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)均購自天根生化科技有限公司; 引物由金唯智生物科技有限公司合成; 蛋白抽提試劑RIPA裂解液(強)和蛋白酶抑制劑Cocktail購自翊圣生物科技有限公司; MyHC-eo抗體由上海友科生物科技公司制備; GAPDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔二抗均購自美國Proteintech公司; ECL化學發光試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。實時熒光定量PCR分析儀ABI 7500 購自美國Biosystems公司; Western blotting 專用電泳槽、轉膜槽和變壓器購自美國Bio-Rad 公司; 化學發光信號檢測儀Lumi-Phos購自美國Thermo Fisher公司; 梯度PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司; 輪轉式石蠟切片機和光學顯微鏡購自日本Olympus公司; 透射電子顯微鏡超薄樣本切片機購自德國Leica公司; 透射電子顯微鏡購自日本Hitachi公司。

1.3 Myh13在不同組織中的表達情況

取8周齡的野生型C57BL/6J小鼠(WT)，分別取眼球、肝臟、腎臟、脾臟、胃、腸、睪丸等14種器官和血液，以及眼外肌、咀嚼肌、膈肌、腹直肌等8種不同部位肌組織，分別使用RNA提取試劑盒提取總RNA，利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，利用引物Myh13-F和Myh13-R(引物序列見表1)，以Gapdh(引物見表1)為內參基因，采用qRT-PCR檢測Myh13 mRNA在小鼠各組織中的表達情況。同時提取各組織的蛋白成分，采用Western blotting法檢測MyHC-eo蛋白在小鼠各組織中的表達情況。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 gRNA設計

gRNA靶基因設計原則： ①靶序列20 bp后含NGG模式的PAM序列; ②靶序列在基因組水平具有高度唯一性, 以避免脫靶效應。后利用網站(http：//crispr.mit.edu)設計 gRNA，用于CRISPR/Cas9構建Myh13敲除小鼠。經篩選，選擇兩條分別在Myh13的第2外顯子上游和第3外顯子下游的gRNA，序列和位置分別為：

gDNA1(1670-1692)： 5'-CTAGAATCAGGTTAACCAAGGGG -3';

gDNA2(2317-2339)： 5'-AGTAGCAGCCAGCATGAACTTGG-3'。

1.5 Myh13敲除小鼠基因型鑒定

小鼠3周齡時，提取鼠尾基因組DNA。對于F0代小鼠使用引物P1和P2(引物序列見表1)進行PCR擴增，P1和P2分別位于敲除片段前后。PCR產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行Sanger測序以篩選Myh13移碼突變的小鼠。對后續子代小鼠使用引物對P3和P4、P5和P6分別進行PCR擴增(引物序列見表1)。P3是位于靶基因敲除片段上游的正向引物，P4是敲除片段中的反向引物。P5同樣是位于靶基因敲除片段上游的正向引物，P6是敲除片段下游的反向引物。反應體系：10 μL Taq DNA聚合酶、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物、1 μL DNA模板、8 μL去離子水。反應條件： 95 ℃預變性 5 min; 95 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，35 個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物進行質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 qRT-PCR驗證

選取8周齡的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠，根據Stuelsatz等[7]描述的方法分離眼外肌組織，提取組織總RNA, 反轉成cDNA, 以Gapdh為內參，利用引物Myh13-F和Myh13-R(引物序列見表1), 根據試劑盒SuperReal PreMix Plus要求，采用qRT-PCR法檢測各基因型小鼠眼外肌中Myh13 mRNA的表達情況。反應體系如下： 10 μL SuperReal PreMix、1 μL cDNA模板、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物和8 μL無核酸酶去離子水。定量PCR反應條件：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸32 s，40 個循環；72 ℃ 10 min。結果采用2-△△Ct法分析。

1.7 Western blotting驗證

選取8周齡的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠，使用含有蛋白酶抑制劑Cocktail的RIPA強裂解液提取3種基因型小鼠眼外肌中的蛋白，并用BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度，隨后加入5×上樣緩沖液，100℃沸水中煮15 min, 使蛋白充分變性。隨后通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，再轉膜至硝酸纖維素(NC)膜, 含質量分數5%奶粉的封閉液室溫封閉1 h, 加入一抗(MyHC-eo抗體或GAPDH抗體) 4 ℃孵育過夜，TBST洗3次,加入HRP標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h, TBST洗3次。最后，經ECL顯影液在化學發光儀中顯影成像，分析MyHC-eo蛋白的表達情況。

1.8 Myh13敲除小鼠繁殖情況

統計Myh13+/-小鼠自交繁育的子代3種基因型小鼠存活的個體數量, 分析各基因型WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠數量是否符合1∶2∶1的比例，進行孟德爾遺傳分析; 統計子代中不同基因型小鼠中各性別的數量; 分析出生性別比例是否存在偏差。

1.9 Myh13敲除小鼠體質量監測和血生化檢測

取WT、Myh13+/-和Myh13-/-雄鼠各10只，雌鼠各10只，正常飲食喂養，在4～12周齡期間每周稱量一次小鼠體質量，并做體質量變化曲線圖。取8周齡雄性WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠各6只,空腹12h后, 摘取眼球血, 室溫靜置30 min, 離心收集血清，采用希森美康(Sysmex) BX3010檢測血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCHO)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)。

1.10 Myh13敲除小鼠眼外肌H&E染色

選取8周齡的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠各3只, 提取眼外肌組織, 用PBS清洗后于質量分數4%多聚甲醛溶液中固定24 h, 低濃度至高濃度乙醇脫水, 二甲苯處理后石蠟包埋, 采用輪轉式切片機切片。對切片進行HE染色, 用中性樹膠封固, 于顯微鏡下觀察各基因型小鼠眼外肌病理學形態，并采用CellSens Entry圖像分析軟件測量高倍鏡下眼外肌眶層(orbital layer)和球層(global layer)肌纖維橫截面積。

1.11 Myh13敲除小鼠眼外肌透射電鏡觀察

在無菌條件下取8周齡的WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠各3只，提取眼外肌組織，后立即置于質量分數為2.5%戊二醛中固定24 h, 隨后取出組織塊, 用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗后，10 mg/L鋨酸固定1.5 h，經生理鹽水徹底沖洗干凈后進行乙醇梯度脫水，再轉入丙酮中，包埋，制作超薄切片，飽和醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，于透射電子顯微鏡下觀察。

1.12 統計分析

使用SPSS Statistics 17.0軟件進行數據分析。結果采用χ2檢驗(Chi-square test)或單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統計分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中Myh13的表達水平

結果表明，Myh13特異性高表達于眼外肌中,而在眼球、肝臟、腎臟、脾臟和胃等各個器官中未檢測到表達(圖1A和1B)，在咀嚼肌和腹直肌等其他肌肉組織中也未檢測到表達(圖1C和1D)。

2.2 Myh13敲除小鼠DNA、RNA和蛋白水平驗證

圖1 小鼠Myh13在不同組織中的表達水平Figure 1 Expression of Myh13 in different tissues of mice

Myh13敲除小鼠中，純合移碼突變的F0代小鼠原始測序序列為： CGTCCCTTGACTTTAGC——ATGAACTTGGGAGC，與WT小鼠序列比對，刪除769bp。子代小鼠的基因型鑒定顯示, 在WT小鼠中, 僅擴增出361 bp未敲除的基因片段; Myh13-/-小鼠中, 僅擴增出270 bp的切除后基因片段。在Myh13+/-小鼠中, 均可見上述兩個位置的條帶(圖2A)。與WT相比，Myh13+/-小鼠眼外肌中Myh13 mRNA表達減少，Myh13-/-小鼠眼外肌中Myh13 mRNA不表達(圖2B)。并且，Myh13+/-小鼠眼外肌中，MyHC-eo蛋白表達下降，Myh13-/-小鼠眼外肌中幾乎檢測不到MyHC-eo蛋白的表達(圖2C)。以上結果表明，Myh13敲除小鼠中該基因成功剔除，可用于后續分析。

2.3 Myh13敲除小鼠繁殖情況

結果表明, 雜合子小鼠的子代中WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠占總體比例分別為23.9%、50.5%和25.7%，接近1∶2∶1，符合孟德爾遺傳規律，說明Myh13的敲除并不會影響胚胎發育，也不會導致胚胎致死的現象發生(表2)。各個基因型小鼠的性別比接近1∶1, 無明顯的性別偏移現象(表3)。

2.4 Myh13敲除小鼠體質量及血清生化檢測

WT、Myh13+/-和Myh13-/-三種基因型小鼠體質量變化曲線圖顯示，雌性小鼠和雄性小鼠的體質量在不同基因型之間差異無統計學意義(圖3)。同時，也未檢測到8周齡小鼠的空腹血糖、血脂等血清生化指標存在明顯異常(表4)。上述結果提示，Myh13基因敲除對于小鼠的基礎代謝、肝功能、腎功能和心臟功能均沒有明顯影響。

2.5 Myh13敲除小鼠眼外肌H&E染色分析及電子顯微鏡觀察

光鏡下，Myh13+/-和Myh13-/-小鼠的眼外肌中未見明顯的病理改變，無結締組織或脂肪組織增加的現象, 也無炎癥或肌肉萎縮的現象(圖4A)。經計數, WT、Myh13+/-和Myh13-/-小鼠眼外肌眶層肌纖維數量分別為(526±49)條、(515±44)條和(519±50)條; 眼外肌球層肌纖維數量分別為(348±29)條、(339±43)條和(356±36)條; 眼外肌眶層橫截面積分別為(183.04 ±23.15) μm2、(187.10 ±25.76)μm2和(179.67±23.36) μm2; 眼外肌球層橫截面積分別為(374.34 ± 38.00) μm2、 (390.51 ± 35.41) μm2和(387.91±34.87) μm2, 差異均無統計學意義(P＞0.05)。電子顯微鏡下，三種基因型小鼠眼外肌纖維的細胞膜完整，肌原纖維排列整齊，肌節結構清晰，線粒體和細胞核正常。但與WT小鼠相比，Myh13+/-眼外肌中可見散在脂滴沉積，Myh13-/-可同時觀察到散在脂滴沉積和肌質網擴張的現象(圖4B)。由此提示，Myh13的敲除對小鼠的眼外肌雖然并不會引起光學顯微鏡下的病理變化，但是會影響肌纖維內部的超微觀結構，可能會對小鼠的眼外肌功能產生影響。

圖2 Myh13敲除小鼠的基因型鑒定及其眼外肌中Myh13的表達水平Figure 2 Genotype identification of Myh13 knockout mouse and the expression of Myh13 gene in extraocular muscles

表2 雜合子小鼠自交產生的子代各基因型數量Table 2 Genotypic ratio in the offsprings from the self-cross of heterozygotes

表3 子代3種基因型小鼠的性別比Table 3 Analysis of sex ratio in three genotypes of offsprings

圖3 三種基因型雄鼠和雌鼠的體質量比較Figure 3 Comparison of body weight among three genotypes of male and female mice

表4 三種基因型小鼠血清生化檢測Table 4 Serum biochemical analysis in three genotypes of mice

圖4 三種基因型小鼠眼外肌HE染色和電鏡觀察Figure 4 HE staining and electron microscopic observation for extraocular muscles from mice with three genotypes

3 討論

人類MYH13定位于17p13.1，與MYH1、MYH2、MYH3、MYH4和MYH8相鄰。但是，MYH13與位于同一基因簇的其他MYH有兩點不同：MYH13的全長約為64 kb, 是其他MYH基因的2倍;MYH13中外顯子的分布和其他MYH中外顯子的分布沒有相似性[8]。然而，該基因所發揮的生物學功能與MYH家族其他成員相比有何特殊性尚不清楚，并且，MYH13與眼外肌超高速率、低張力、耐疲勞特點的相關性尚不明確。

本研究中，在WT小鼠中檢測了Myh13在不同組織中的表達水平，小鼠中Myh13特異性高表達于眼外肌中，與該基因在人類各個組織中的表達譜一致。經驗證， Myh13敲除小鼠的目的基因發生移碼突變，實現了基因組水平的基因剔除。進一步驗證發現，Myh13+/-小鼠眼外肌中Myh13表達減少，Myh13-/-小鼠眼外肌中Myh13不表達。至此說明, 可利用該Myh13敲除小鼠研究人類MYH13的生物學功能。

與MYH家族相關的整體動物研究[9]表明，MYH多個成員的突變與人類疾病密切相關, 例如，MYH6和MYH7的突變與人類多種心肌疾病相關。在人類中, MYH6和MYH7分別在心房肌纖維和心室肌纖維中表達，而在嚙齒類動物如小鼠中, 心房肌纖維和心室肌纖維均表達Myh6。Myh6 p.R403Q突變的雜合子小鼠在出生12～25周出現心肌纖維化、肌節異常和心功能異常的表型，敲除心肌Myh6也同樣可以使小鼠發生嚴重的心肌疾病[10]，而Myh6純合突變的小鼠呈現胚胎致死[11]。MYH9相關性疾病(MYH9-related disease, MYH9-RD)是一類由MYH9突變引起的遺傳性血小板減少癥, 有時突變還可引起非血液系統的癥狀如腎小球腎炎、神經性耳聾和白內障等[12]。Myh9敲除小鼠模型顯示, Myh9+/-并沒有出現與人類類似的MYH9-RD的癥狀, 而Myh9+/-小鼠呈現胚胎致死[13]。Zhang等[14]建立了3種Myh9突變(p.R702C、p.D1424N和p.E1841K)敲入小鼠模型, 發現p.D1424N和p.E1841K突變的純合子小鼠和三種突變的雜合子小鼠均出現血小板減少的癥狀，而p.R702C純合突變小鼠出現胚胎致死。迄今尚無文獻報道與MYH13相關的動物模型，故本研究是首次對Myh13敲除小鼠進行表型分析。

在表型分析中，本研究發現Myh13的敲除不會導致小鼠發生胚胎致死的現象，對小鼠的體質量、基礎代謝等也沒有明顯影響，說明Myh13在小鼠的胚胎發育、生長發育等過程中并不是一個至關重要的基因。Altick等[15]和田亮等[16]均發現斜視患者的眼外肌中MYH13表達顯著減少。HE染色的結果提示，斜視患者的眼外肌纖維橫截面積減少，數量減少、排列紊亂、結締組織增加等[17]。本研究對Myh13敲除小鼠的眼外肌也進行了觀察, HE染色結果顯示, 與WT小鼠相比, Myh13+/-和Myh13-/-小鼠的眼外肌橫截面積和肌纖維數量沒有明顯變化，且未見明顯病理改變；電子顯微鏡觀察顯示，敲除Myh13后，小鼠眼外肌中可見散在肌質網擴張和脂滴沉積的現象。以往研究[18,19]表明，在先天性肌病和肌肉萎縮小鼠模型的骨骼肌組織中，也可見肌質網擴張和脂滴沉積。本研究表明，在小鼠中，Myh13的敲除可導致眼外肌微觀結構改變，這一改變是否對眼外肌功能、眼球運動等產生影響，有待進一步探討。