B6-Co小鼠眼瞼成纖維細胞增殖、凋亡及遷移能力實驗研究

景 瑾, 張海駿,, 杜利莉, 姬桂青, 邵義祥

(1. 南通大學比較醫學研究所, 南通 226001;2. 南通大學江蘇省神經再生重點實驗室, 南通 226001)

眼瞼有保護眼球的作用。任何可能造成眼瞼發育障礙、組織缺損、位置異常和眼瞼啟閉功能障礙的病變，都可影響眼瞼的正常生理功能，以致失去保護眼球的作用，危及眼球的安全[1]。眼瞼功能異常會導致眼睛的各種疾患，如角膜炎、角膜混濁、上瞼下垂等。而導致這些眼病的因素有感染、遺傳、營養不良、外傷等多種因素[2]。要研究這些因素對視覺功能的影響，以及各因素的疊加影響、相互作用等等，都必須借助疾病動物模型來深入研究。

南通大學實驗動物中心[3]用C57BL/6J(B6)背景品系小鼠自主培育建立的遺傳穩定的C57BL/6J-corneal opacity (B6-Co)突變系小鼠, 與國內[4]和國際[5]上研究的出生時眼瞼開放(eye open at birth，EOB)表型的模型小鼠相似，即在出生時眼瞼閉合不全。正常B6小鼠胚胎在妊娠16.5～18.5 d時完成眼瞼融合，出生時眼瞼閉合，出生后12～14 d睜眼。而B6-Co突變系小鼠在妊娠期胚胎未能順利完成眼瞼的融合，并保持開放狀態直至出生，即呈典型的EOB表型[6]。Wu等[7]研究表明，B6-Co小鼠眼瞼角質形成細胞偽足形成受到影響，使得該突變系小鼠胚胎妊娠16.5～18.5 d未能完成眼瞼融合，導致了EOB表型。盧澤艷等[8]首次成功培養B6-Co小鼠眼瞼角質形成細胞，發現其遷移能力顯著降低，形成細胞遷移障礙，引起了EOB表型。但眼瞼組織中的另一類型的主要細胞是成纖維細胞，該類型細胞在B6-Co小鼠眼瞼形態建成中有何變化與影響呢？本實驗擬通過培養正常B6小鼠和B6-Co小鼠成纖維細胞，對小鼠眼瞼成纖維細胞增殖、凋亡及遷移能力進行比較研究，從而為闡明先天性眼瞼發育異常的形成機制提供實驗依據，也可為人類遺傳性眼瞼疾病、角膜病的早期診斷、預防和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級B6、 B6-Co小鼠由南通大學實驗動物中心提供[SCXK (蘇) 2014-0001]; 飼養在SPF級屏障動物房內, 室內溫度(21±1) ℃, 相對濕度(55±5)%,自由采食和飲水, 晝夜明暗交替時間12 h/12 h, 定期更換籠具、墊料[SYXK(蘇)2015-0016]。B6 雄性與B6雌性小鼠以 1∶2 比例配對, 共10籠; B6-Co雄性小鼠與B6雌性或B6 雄性與B6-Co雌性小鼠以1∶2 比例配對，共10籠。每日上午8點之前檢查小鼠陰道栓。見栓當日胚齡記為 0.5 d。

1.2 主要儀器及試劑

CO2細胞培養箱購自美國Thermo公司; 倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司; 抗菌素、體積分數0.25%胰蛋白酶-EDTA和體積分數0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司; 胎牛血清和DMEM基礎培養基均購自美國Hyclone公司; CCK8試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購自中國碧云天生物技術公司; Vimentin一抗購自英國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠眼瞼成纖維細胞的分離和培養 取妊娠18.5 d的母鼠，頸椎脫臼處死后放入體積分數75%的乙醇溶液浸泡5 min消毒待用; 剖開孕鼠腹部，取出胎鼠(B6-Co小鼠需判斷其眼部開合狀態，開則為EOB表型小鼠，閉眼則棄去); 用鑷子取下小鼠的眼瞼組織, 剪刀剪碎; 加2 mL胰酶，于37 ℃消化5 min; 100目網篩過濾, PBS沖洗; 離心, 棄上清;完全培養基重懸沉淀，于37℃、體積分數5% CO2培養箱培養; 待原代細胞長滿后，細胞1∶2傳代。

1.3.2 小鼠眼瞼成纖維細胞的鑒定 在細胞培養至第3代時，取部分細胞于圓玻片上進行細胞爬片培養; 待細胞長至適當密度時，吸除培養基，PBS輕洗細胞2次×3 min，再加入質量分數4%多聚甲醛固定20 min，PBS輕洗細胞3次×3 min; 體積分數0.5% Triton X-100通透20 min，PBS輕洗細胞3次×3 min; 體積分數3%H2O2室溫15 min，PBS輕洗細胞3次×3 min; 5%BSA封閉0.5 h; 滴加一抗(1∶100)，4 ℃孵育過夜，PBS輕洗細胞3次×3 min; 滴加二抗(1∶200)，37℃反應30 min，PBS輕洗細胞3次×3 min; 二氨基聯苯胺(DAB)底物顯色，室溫下避光孵育10 min，純水洗細胞; 蘇木精染核2 min。 純水輕洗細胞4次×5 min; 依次放入體積分數70%乙醇溶液2 min、體積分數90%乙醇溶液2 min、無水乙醇2 min、二甲苯酒精5min、二甲苯5min，封固。

1.3.3 小鼠眼瞼成纖維細胞增殖水平的檢測 取對數生長期細胞, 胰酶消化后離心收集, 重懸細胞, 細胞計數調整為 2×104/mL。將制備好的細胞懸液邊輕輕混勻邊加入96孔板，每孔加入 100 μL; 將接種好的細胞培養板放入培養箱中培養過夜，空白對照組只加入培養基不加細胞, 每組設6個復孔取均值, 實驗重復3次。在培養1d、2d、3d和4 d、5 d后CCK8法測細胞活力; 不同時間組及對照組每孔加入10 μL CCK8 溶液，培養箱繼續孵育約2 h，在酶標儀450 nm 處測量各孔的吸光度(A)值。

1.3.4 小鼠眼瞼成纖維細胞凋亡水平的檢測 取對數生長期細胞，種于6孔板中，待細胞長至約80%時，將6孔板內各孔的培養基收集至相應離心管中;用PBS洗滌細胞兩遍，洗滌液也回收至離心管內;加入100 μL不含EDTA的胰酶，消化4～5 min，鏡下看見細胞變圓時加入適量完全培養基終止消化，吹打數次；吸取細胞消化液至上述離心管，1 200 r/min, 離心5 min; 小心倒去上清液, 加入適量PBS洗滌，離心，重復2次; 去除上清液，各離心管加入100 μL 緩沖液，重懸細胞，然后依次加入兩種染液AV和PI各5 μL，并設3個對照組，分別為空白單染PI、空白單染AV、及全空白組，分別加入PI、AV及緩沖液5 μL; 各組細胞輕微混勻，室溫下避光反應20 min; 各加入400 μL緩沖液，通過400目細胞濾網過濾，上機檢測; 以右上象限為晚期凋亡細胞和右下象限為早期凋亡細胞，每組細胞3個復孔，重復3次。

1.3.5 小鼠眼瞼成纖維細胞遷移能力的檢測 本實驗選用直徑6.5 mm、孔徑8 μm的Transwell小室;0.25%胰酶將處于對數生長期的細胞消化, 以DMEM基礎培養基重懸并調整細胞密度至5×105/mL; 加100 μL細胞懸液至Transwell上室，加入500 μL DMEM培養基(含5%胎牛血清)至Transwell下室，于CO2培養箱中培養24 h; 取出Transwell小室，吸盡培養基，PBS清洗3次; 放入質量分數4%多聚甲醛溶液中固定20 min; 棄固定液，PBS搖床洗10 min; 放入結晶紫中室溫染色10 min; PBS輕洗2次, 每次5 min; 用脫脂棉擦去小室上表面細胞, 顯微鏡下取5個視野拍照計數, 以備后續統計、分析。

1.4 統計分析

所有實驗計量數據均采用STATA V 10.0統計學軟件進行處理，應用GraphPad Prism 5統計分析軟件進行統計作圖。數據結果用s表示，采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠眼瞼成纖維細胞的形態

倒置相差顯微鏡下觀察，B6-Co、B6小鼠眼瞼所取細胞外形上無明顯差異(圖1)，細胞均多為梭形，核大多位于胞質中央，且大小均一，細胞集落性生長，呈渦旋樣或平行樣排列，符合成纖維細胞特征。

2.2 小鼠眼瞼成纖維細胞的鑒定

成纖維細胞的標志蛋白是波形蛋白(Vimentin)，因此通過免疫組織化學染色法鑒定所分離的細胞及其純度。B6-Co、B6小鼠眼瞼組織胰酶消化所得的細胞100%表達成纖維細胞特征蛋白Vimentin(圖2),Vimentin表達于胞質中且呈棕黃色，蘇木精染核呈藍色，細胞呈梭形，符合成纖維細胞特征。本實驗成功培養出B6-Co、B6小鼠成纖維細胞，且沒有雜細胞污染。

2.3 CCK-8法檢測小鼠眼瞼成纖維細胞增殖能力

B6-Co組成纖維細胞在培養1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后細胞增殖水平(A450值)顯著低于B6組(P＜0.01)(表1)。這表明B6-Co小鼠眼瞼成纖維細胞增殖能力有顯著缺陷。

2.4 Annexin V-FITC法檢測小鼠眼瞼成纖維細胞的凋亡能力

通過流式分析檢測B6組、B6-Co組成纖維細胞的凋亡情況，以右上象限代表晚期凋亡細胞，以右下象限代表早期凋亡細胞，根據細胞所占比例計算凋亡率(圖3)，與B6組成纖維細胞相比，B6-Co組的早期凋亡比例極顯著上升(P＜0.01)，這說明B6-Co小鼠眼瞼成纖維細胞更易凋亡。

2.5 Transwell檢測小鼠眼瞼成纖維細胞遷移能力

通過Transwell遷移實驗來測定B6-Co、B6成纖維細胞的遷移能力，結果(圖4)顯示，B6-Co組的成纖維細胞在Transwell小室接種培養24 h后，其穿過小室的細胞數量極顯著低于B6組(P＜0.01)，這表明B6-Co小鼠眼瞼成纖維細胞遷移能力受到嚴重影響。

圖1 B6-Co、B6小鼠眼瞼成纖維細胞形態觀察Figure 1 Morphology of eyelid fibroblasts in B6-Co and B6 mice

圖2 B6-Co、B6小鼠眼瞼成纖維細胞的鑒定Figure 2 Identification of eyelid fibroblasts in B6-Co and B6 mice

表1 B6-Co、B6小鼠眼瞼成纖維細胞增殖能力的檢測Table 1 Detection of proliferation ability of eyelid fibroblasts in B6-Co and B6 mice

3 討論

先天性角膜混濁[9]是人類較為常見的眼部疾病之一，多為眼瞼發育缺陷所引起[10]。角膜混濁可以發生在角膜中央或周邊部，甚至彌漫于全角膜，并伴有眼部其他發育異常，最終引發失明[11]。因此，眼瞼發育機制一直受到發育生物學、眼科學研究者的高度關注。本研究所采用的角膜混濁表型的B6-Co小鼠，在胚胎發育后期，上下眼瞼融合失敗, 導致小鼠出生時眼瞼閉合不全，出生后極易發生角膜炎，并逐步發展為角膜混濁，其病理發展過程與人類角膜混濁的病理發展過程極為相似，是研究人類角膜病的良好動物模型，也是研究眼瞼發育生物學及其分子調控機制的極好動物模型。

成纖維細胞是疏松結締組織的主要細胞成分[12],其功能活動旺盛，細胞質嗜弱堿性，表現為明顯的蛋白質合成和分泌活動。成纖維細胞是皮膚真皮網織層中最重要的細胞，常附著在膠原纖維上，能合成和分泌大量膠原蛋白，對維持皮膚的功能具有重要作用。此外，成纖維細胞還對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損的修復有著重要作用[13]。而細胞增殖是細胞的重要生理功能之一，是生物體的重要生命特征。細胞的增殖是生物體生長、發育、繁殖以及遺傳的基礎。本實驗研究表明，B6-Co小鼠的眼瞼成纖維細胞增殖能力極顯著低于B6小鼠，是造成該突變系小鼠出生時眼瞼不能閉合的重要原因之一。與Curtain等[14]曾報道的成纖維細胞影響小鼠眼瞼發育，引發眼瞼融合失敗的結果相一致。

圖3 B6-Co、B6小鼠眼瞼成纖維細胞凋亡能力的檢測Figure 3 Detection of apoptosis of eyelid fibroblasts in B6-Co and B6 mice

細胞凋亡是為維持內環境穩定，生物體細胞主動消亡的過程，是細胞生物體維持機體平衡的關鍵。細胞凋亡在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要作用[15]，在生物體進化、內環境穩定以及多個系統發育中發揮重要作用，但過度凋亡則會引起機體發育缺陷等一系列問題。在本實驗中，B6-Co小鼠眼瞼成纖維細胞的早期凋亡比例比B6小鼠極顯著上升。

細胞遷移也稱細胞爬行，是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質的梯度后產生的移動。細胞遷移為細胞頭部偽足的延伸、新的黏附建立、細胞體尾部收縮在時空上的交替過程。細胞遷移是正常細胞的基本功能之一，是機體正常生長發育的生理過程，在胚胎發育、傷口愈合、免疫反應等生理過程中發揮重要作用[16]。本研究分析比較了B6-Co小鼠與B6小鼠眼瞼成纖維細胞遷移能力的差異，發現B6-Co小鼠的眼瞼成纖維細胞遷移能力極顯著低于B6小鼠, 遷移能力受到嚴重阻礙。

圖4 B6-Co、B6小鼠眼瞼成纖維細胞遷移能力的檢測Figure 4 Detection of migratory ability of eyelid fibroblasts in B6-Co and B6 mice

實驗結果表明，B6-Co小鼠眼瞼成纖維細胞雖然在形態上與B6小鼠眼瞼成纖維細胞沒有明顯差異, 但是增殖和遷移能力都顯著下降, 且凋亡水平顯著上升。結果提示, B6-Co小鼠出生時眼瞼閉合不全與其胚胎發育期間眼瞼成纖維細胞的增殖能力、凋亡水平及遷移能力的改變有一定的關聯，但其關聯程度及影響B6-Co小鼠眼瞼成纖維細胞增殖、凋亡、遷移的分子調控機制仍有待深入研究。