小鼠脾淋巴細胞對人HepG2細胞殺傷活性檢測方法的建立

陳麗玲, 鐘友寶, 劉 漩, 陳 來, 袁可望, 黃麗婷, 李姍姍

(江西中醫藥大學, 南昌 330004)

從動物模型與臨床實際腫瘤的相近性而言, 現有腫瘤動物模型中, 人腫瘤的異種移植模型是最具有應用價值和前景的。而現有成熟的以免疫缺陷動物作為載體的人源腫瘤模型存在短板： 無胸腺裸小鼠的T細胞生成障礙導致其無法用于移植腫瘤與特異性免疫系統相互作用的研究[1,2]。因此, 建立既能保留人源腫瘤生物學特性, 又具有正常免疫功能的動物模型是腫瘤研究, 尤其是腫瘤免疫研究急需解決的問題。我們擬利用“獲得性免疫耐受”的機制, 即“在胚胎時期, 體內已有的針對多種抗原具有免疫活性的淋巴細胞克隆, 若與某種抗原(包括自身的或人工導入的) 相遇, 與其對應的淋巴細胞克隆即被破壞或抑制,出生后只對胚胎期曾接觸過的抗原形成耐受, 而對胚胎時期從未接觸過的抗原仍有免疫應答[3]”, 在具有完善免疫系統的KM小鼠基礎上, 建立適用于人來源的、且免疫功能相對正常的人腫瘤異種移植動物模型, 以達到為腫瘤研究, 尤其是腫瘤免疫研究提供新的臨床前研究模型的目的。在模型建立初期, 我們擬向孕鼠子宮內的胎鼠注射人肝癌HepG2細胞, 之后在成功出生且存活的胎鼠肝臟原位移植人肝癌HepG2細胞, 評價成瘤效果, 并考察荷瘤小鼠的免疫功能和對HepG2細胞及其他人腫瘤瘤株的排斥情況。在考察小鼠脾淋巴細胞對人肝癌HepG2細胞殺傷作用的過程中, 計劃檢測樣本量較大, 因此需要建立一種操作方便、快速的檢測方法。目前經常使用的細胞殺傷活性檢測方法中, 經典的51Cr釋放法存在自然釋放率較高、放射性會對細胞及操作人員造成傷害等不足; 乳酸脫氫酶(LDH)釋放法因影響因素較多和背景信號的干擾等問題, 應用有限[4]; 酶聯免疫斑點(Enzyme-linked immunospot, ELISPOT)檢測技術、主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex, MHC)四聚體顯示T細胞受體的染色技術和胞內細胞因子染色等技術, 只能通過間接檢測T細胞表面受體或細胞因子的水平反應細胞毒性T 淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocytes, CTL)活性[5]。

羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)是一種本身不發熒光的活體染料，它可穿透細胞膜，被胞內酯酶轉化成具有綠色熒光的氨基反應性羧基熒光素琥珀酰亞胺酯，同時失去自由透過細胞的能力，可穩定標示活細胞[6-8]。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑, 其不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜，嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。在效應細胞與靶細胞混合前，先將靶細胞用CFSE染色, 染色后的靶細胞與效應細胞混合作用后，再用PI染色，采用流式細胞術即可區分被殺傷靶細胞及存活靶細胞，并體現效應細胞的死亡情況，測定效應細胞對靶細胞的殺傷活性, 且檢測速度較快。

本實驗擬建立基于流式細胞術的評價小鼠脾淋巴細胞對人HepG2細胞殺傷活性的方法，以準確檢測模型小鼠脾細胞對人腫瘤細胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠，4周齡，體質量18～22 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2013-0004]。飼養于江西中醫藥大學實驗動物科技中心[SYXK(贛)2017-0004]。實驗獲得江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會的批準(倫理審查證號：JZLLSC207-0021)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 細胞株

人肝癌HepG2細胞由江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心惠贈(購自中國科學院上海細胞庫)。

1.3 藥品及主要試劑

CFSE(批號為S8269)購自美國Selleck生物科技有限公司; PI(批號為2018/12)購自合肥新恩源生物技術有限公司; 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(批號為20171108)、DMEM高糖培養基(含雙抗，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)(批號為20170812)和胎牛血清(批號為RY3201)均購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司; 紅細胞裂解液(批號為20170731)、胰蛋白酶(批號為T1300)和臺盼藍染液(批號為： 20161122)均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 主要儀器

CO2培養箱(型號為C150)購自德國賓德有限責任公司，流式細胞儀(型號為FACSVerse)購自美國BD醫療器械有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 靶細胞人肝癌HepG2細胞的培養 人肝癌HepG2細胞置于含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養基中，移入CO2培養箱，于37 ℃、體積分數5% CO2及飽和濕度條件下培養。

1.5.2 效應細胞小鼠脾淋巴細胞的制備 摘眼球取血后，將小鼠浸泡在體積分數75%乙醇中3 min，移至超凈臺中無菌取脾臟，開左側腹部皮膚，分離皮下組織和肌肉，暴露并小心分離脾臟, 放入預冷PBS中。將脾臟置于200目不銹鋼網上，用注射器內芯頭研磨成單細胞，收集后1 000 r/min離心5 min, 棄上清, 加入3倍量紅細胞裂解液, 4 ℃靜置15 min, 其間輕輕渦旋混勻2次, 1 000 r/min離心10min, 棄上清, 預冷PBS沖洗, 含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基調整細胞懸液至不同濃度備用[18]。

1.5.3 靶細胞人肝癌HepG2細胞的標記

1.5.3 .1 CFSE及PI 對靶細胞的區分效果 6孔板接種HepG2細胞，貼壁，至匯合度約為80%，用5 μmol/mL的CFSE標記10 min, PBS洗1次, 加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基及無水乙醇,使無水乙醇的終濃度分別為0.4 mol/L、0.8 mol/L、1.6 mol/L[9], 培養6 h后, 收集細胞, PBS沖洗，加入PI至終濃度為12.5 μg/mL，上流式細胞儀檢測。

1.5.3 .2 CFSE標記對人肝癌HepG2細胞的毒性 24孔板接種HepG2細胞，貼壁，至匯合度約為80%，分別以2.5 μmol/mL、5.0 μmol/mL、10 μmol/mL的CFSE標記10 min，每隔1 h收集細胞，PBS沖洗，加入PI至終濃度為12.5 μg/mL，上流式細胞儀檢測細胞存活率，至第18 h結束。未經CFSE標記的細胞作為對照。

1.5.3 .3 CFSE標記人肝癌HepG2細胞熒光強度的時間動力學分析 24孔板接種HepG2細胞, 貼壁, 至匯合度約為80%, 分別以2.5 μmol/mL、5.0 μmol/mL、10 μmol/mL的CFSE標記10 min，每隔1 h收集細胞，PBS沖洗，上流式細胞儀檢測熒光值(Median fluorescent intensity，MFI)，至18 h結束。

1.5.4 CFSE及PI對效靶細胞的區分效果 24孔板接種HepG2細胞，貼壁，至匯合度約為80%，此時HepG2細胞數約為4×105/孔。以2.5 μmol/mL的CFSE標記10 min，PBS洗1次，加入1 mL濃度為4×106/mL的小鼠脾淋巴細胞懸液，以效靶比10∶1作用6 h，收集細胞，PBS沖洗，加入PI至終濃度為12.5 μg/mL，上流式細胞儀檢測。

1.5.5 效靶作用時間及效靶比對試驗結果的影響24孔板接種HepG2細胞，貼壁，至匯合度約為80%，此時HepG2細胞數約為4×105/孔。以2.5 μmol/mL的CFSE標記10 min，PBS洗1次，分別加入1mL濃度為2×106/mL、4×106/mL、8×106/mL、1.6×107/mL、3.2×107/mL、4×107/mL的小鼠脾淋巴細胞懸液，以效靶比5∶1、10∶1、20∶1、40∶1、80∶1、100∶1分別作用6 h、12 h和18 h，收集細胞，PBS沖洗，加入PI至終濃度為12.5 μg/mL，上流式細胞儀檢測細胞的存活率，并按下式計算殺傷率。

殺傷率(%)=(陰性對照靶細胞存活率-試驗組靶細胞存活率)/陰性對照靶細胞存活率×100%

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 CFSE標記對人肝癌HepG2細胞的作用

2.1.1 CFSE 及PI 對靶細胞的區分效果 流式細胞術檢測結果表明, 采用CFSE/PI 雙標記能有效分離各組群： CFSE+PI-、CFSE+PI+、CFSE-PI+、CFSE-PI-,其中CFSE+PI-為未被乙醇殺傷的靶細胞，CFSE+PI+為被乙醇殺傷的靶細胞，CFSE-PI+為CFSE標記前死亡的效應細胞。隨著無水乙醇的濃度逐漸增加，CFSE+PI+細胞，即被乙醇殺傷的靶細胞的比例逐漸增加(圖1)。

2.1.2 CFSE 標記人肝癌HepG2細胞的毒性 流式細胞術檢測結果表明，1～18 h，各濃度CFSE標記的人肝癌HepG2細胞的存活率無明顯下降，表明在18 h以內，CFSE對人肝癌HepG2細胞的存活無明顯影響(圖2)。

2.1.3 CFSE 標記人肝癌HepG2細胞熒光強度的時間動力學 流式細胞術檢測結果表明，1～18h，隨著時間的推移，各濃度CFSE標記的人肝癌HepG2細胞的MFI值均逐漸下降, 6 h后趨于穩定，12 h后又有較小范圍波動。在6～12 h，以2.5μmol/mL和5.0 μmol/mL的CFSE標記后的MFI值更為穩定(圖3)，表明后續測定細胞殺傷活性時，效應細胞和靶細胞的作用時間以6～12 h為宜。

圖1 CFSE 及PI 對靶細胞區分效果Figure 1 The differentiating effect of CFSE and PI on target cells

圖2 CFSE對人HepG2細胞的毒性Figure 2 The cytotoxicity of CFSE to human HepG2 cells

2.2 CFSE 及PI 對效靶細胞的區分效果

流式細胞術檢測結果表明，采用CFSE/PI 雙標記能有效分離殺傷實驗所需各組群：CFSE+PI-、CFSE+PI+、CFSE-PI+、CFSE-PI-，其中 CFSE+PI-為未被殺傷的靶細胞，CFSE+PI+為被殺傷的靶細胞，CFSE-PI+為效靶相互作用過程中死亡的效應細胞和CFSE標記前死亡的效應細胞，CFSE-PI-為效靶相互作用過程中存活的效應細胞(圖4)。

2.3 效靶作用時間及效靶比對試驗結果的影響

流式細胞術檢測結果表明，效靶比在5∶1至40∶1時，效靶作用時間為12 h的細胞殺傷率較18 h及6 h高; 效靶比在40∶1以上時，則殺傷率隨效靶作用時間的延長而增加。其中效靶比為10∶1時，效靶作用時間為12 h與作用時間為6 h的殺傷率相比有極顯著性差異(P＜0.01)，效靶比為100∶1時，效靶作用時間為12 h與作用時間為6 h的殺傷率相比有顯著性差異(P＜0.05)(表1)。

效靶作用時間相同時，細胞殺傷率總體隨效靶比的增加而增加，但效靶比在10∶1至80∶1間無顯著性差異，直至效靶比上升至100∶1時，殺傷率才有明顯增加： 效靶作用時間為12 h時，效靶比100∶1與10∶1相比有顯著性差異(P＜0.05)，效靶作用時間為6h時，效靶比100∶1與10∶1相比有極顯著性差異(P＜0.01)(表1)。

圖3 CFSE對人HepG2細胞熒光強度的時間動力學曲線Figure 3 The time dynamics of fluorescent density of CFSE-labeled human HepG2 cells

圖4 CFSE 及PI 對效靶細胞區分效果Figure 4 The differentiating effect of CFSE and PI on effector cells and target cells

表1 效靶作用時間及效靶比對細胞殺傷率的影響Table 1 The effect of action time between effector and target cells and the effector to target cell ratios on the specific cellular killing activity %

3 討論

在建立既能保留人體腫瘤生物學特性，且免疫功能相對正常的人腫瘤異種移植動物模型的過程中，我們需要找到一種方便操作的檢測小鼠脾細胞對人腫瘤細胞殺傷作用的方法以應對較大的檢測需求[10]。經典的51Cr釋放法、LDH釋放法、ELISPOT技術和MHC四聚體染色等技術由于各種原因，不能完全滿足本實驗對殺傷作用檢測的要求。

流式細胞術是利用流式細胞儀進行的一種高速單細胞定量分析和分選技術，能對檢測的每個細胞進行多個參數的檢測。本實驗通過采用適當的不同熒光染料，即可有效區分多種細胞及其存活狀態，而流式細胞術這種基于單細胞水平上的檢測手段也保證了多種細胞共檢測時各種細胞間數量差距較大時檢測的準確性和可靠性。

本文對流式細胞術檢測小鼠脾細胞對人HepG2細胞殺傷活性的方法進行了初步的標準化探討：CFSE和PI雙染可有效區分各細胞群，實驗中采用的各濃度CFSE對人肝癌HepG2細胞未見明顯毒性。CFSE 標記人肝癌HepG2細胞熒光強度的時間動力學分析表明，2.5 μmol/mL和5.0 μmol/mL的CFSE標記的MFI值在6～12 h更為穩定, 且效靶作用時間為12 h的殺傷率較6 h高, 所以確定效靶作用時間為12 h。在對效靶比的考察中，結果表明10∶1和100∶1為適宜效靶比, 但考慮在模型建立過程中, 需對新生小鼠的脾細胞進行特異殺傷活性檢測, 可能存在采集的脾細胞數量較少的情況, 故確定效靶比為10∶1。最終確定的實驗方法為： 24孔板接種HepG2細胞, 貼壁, 至細胞匯合度約80%時, 以2.5 μmol/mL的CFSE標記10 min, PBS洗1次, 加入含10%胎牛血清DMEM高糖培養基調整濃度的小鼠脾淋巴細胞懸液, 以效靶比10∶1相互作用12 h, 收集細胞, PBS沖洗, 加入PI至終濃度為12.5 μg/mL,上流式細胞儀檢測細胞的存活率, 并計算殺傷率。

本方法可有效、精確評價小鼠脾淋巴細胞對人肝癌HepG2細胞的殺傷作用，為后續模型的建立打下了基礎。