視網膜母細胞瘤斑馬魚模型及rb1基因研究進展

王俐梅, 張 建, 劉忠華, 楊 威

(1. 廣東省生物資源應用研究所, 廣東省動物保護與資源利用重點實驗室,廣東省野生動物保護與利用公共實驗室, 廣州510260;2. 華南農業大學獸醫學院, 廣州510642; 3. 廣州醫科大學基礎醫學院, 廣州 511436;4. 廣東萊恩醫藥研究院有限公司, 廣東省藥物非臨床評價研究企業重點實驗室, 廣州 510990)

視網膜母細胞瘤(Retinoblastoma, RB)是一種常見的發生于嬰幼兒眼內的原發惡性腫瘤[1,2]。目前RB發病的機制主要包括染色體遺傳、染色體突變、病毒感染等。對于RB發生的共識性觀點是： 由視網膜母細胞中rb1雙等位基因突變引發RB蛋白磷酸化缺陷, RB蛋白活性的喪失導致細胞周期受損和細胞增殖失控引起的[3], RB蛋白是參與細胞周期發展、終末分化和DNA復制的主要腫瘤抑制基因[4-6]。世界衛生組織[7]統計表明, RB發病率較低, 全世界平均每16 000～18 000新生兒中只有1例發生RB, 但我國RB患兒的生存率僅為63%, 遠低于發達國家95%的生存率, 因此我國對于RB的研究亟待加強。

雖然RB的發病率較低，但RB的治療在世界范圍內仍然是一個難題，為保住患者生命，往往只能采取眼球摘除或者眼眶內容剜出術。盡管大多數RB患兒存活下來，但他們通常會永久失去視力，因此如何在治愈腫瘤的同時保住眼球和視力成為研究目標，早發現、早診斷是避免手術治療RB疾病的最佳途徑。近幾年基因檢測和編輯技術快速發展，共識性的觀點是在不遠的未來，人類有可能通過基因編輯的方法治療疾病。最近研究[7-11]表明，現有分子生物學及分子遺傳學方法已經能夠實現rb1基因突變檢測。我國在相關研究方面也有明顯進展，孟慶娛等[12]利用基因捕獲技術成功篩選出了視網膜母細胞瘤患者的rb1突變基因，蘭小平等[13]采用Sanger測序與多重連接探針擴增技術相結合的策略探索了母系遺傳性視網膜母細胞瘤家系rb1基因分析與產前診斷。

成功構建RB動物模型是進一步開展相關研究的必備條件，傳統的模式動物在發揮重要作用的同時，基因編輯相關的科學研究從實驗便利性、繁殖率、繁殖速率和成本等方面對模式動物提出了新的需求，在這樣的背景下斑馬魚以其獨特的優點，已經成為了一種引發廣泛關注的新興模式動物。

1 RB斑馬魚模型與其他動物模型的比較分析

斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio)與人類基因同源性高達85%，其信號傳導通路與人類基本近似，生物結構和生理功能與哺乳動物高度相似，且斑馬魚具有飼養成本低、體積小、發育周期短、體外受精、透明易觀察和單次產卵數較高等優點[14]。目前斑馬魚已被美國國家衛生研究院(NIH)列為繼人和小鼠之后的第三大模型動物。基于以上顯著優點，斑馬魚已經應用于以下幾個癌癥研究領域： ①使用化學致癌, 遺傳和異種移植的方法建立癌癥模型; ②用評估腫瘤血管生成; ③研究腫瘤轉移; ④抗腫瘤藥物篩選和藥物毒性評價[15,16]。 RB發病機制研究及治療藥物的研發都需要合適的動物模型。已經報道[17-25]可以用于構建RB模型的動物有小鼠、大鼠、兔、非洲爪蟾、斑馬魚等, 以上動物模型存在各自的優缺點。本文對現有RB動物模型的總結見表1。

雖然斑馬魚RB模型研究尚處于起步階段，但已經有了較多的發現。最近研究[29]表明，通過斑馬魚模型可以從單個細胞水平上監測到標記后的RB細胞的侵襲和轉移過程，且實現了實時動態監測，從而為腫瘤侵襲、轉移和藥物作用的相關研究提供了一個新的思路。本文將綜述現有的RB斑馬魚模型的建立方法以及基于這些模型取得的研究進展，以促進RB相關的研究。

2 構建RB斑馬魚模型的方法

2.1 異種移植RB斑馬魚模型

Hyun 等[25]建立了一種異種移植RB斑馬魚模型,具體做法是： 在斑馬魚卵受精48 h后, 將RB細胞注入斑馬魚胚胎的玻璃體腔。由于斑馬魚胚胎很小且具有光透明性，在胚胎期可以利用共聚焦激光顯微鏡對斑馬魚的眼球成像，進而能夠通過圖像中綠色熒光蛋白(GFP)的強度定量地分析腫瘤細胞群。在不使用藥物的情況下隨著注射的RB細胞數量增加,眼球中GFP強度增強, 預示著腫瘤群體變大。將斑馬魚模型飼養在含有藥物Carboplatin和Melphalan的林格氏液中, 結果顯示特定濃度的藥物Carboplatin和Melphalan能夠分別降低GFP的表達強度30%和28%,這個結果預示斑馬魚模型可以用于篩選抗癌藥物。

表1 RB動物模型建模方法和特點分析Table 1 Modeling methods and characteristics of animal models of retinoblastoma

Chen等[26]建立了另一種類型的異種移植RB斑馬魚模型，方法是：將紅色染料標記的人RB細胞(RB355)和小鼠(SJmRBL-8)細胞植入斑馬魚胚胎的玻璃體內，所使用的斑馬魚的血管內皮細胞能夠表達GFP。由于采用了雙色標記, 能夠看到腫瘤細胞和周圍微血管之間的相互作用，腫瘤細胞附著于血管形成簇, 先是關聯增強, 然后關聯減少, 說明微血管系統可能是腫瘤侵襲的結構基礎。進一步使用藥物Vegf-aamorpholino和Sunitinib對含有RB的斑馬魚胚胎進行了治療, 結果表明藥物Vegf-aamorpholino和Sunitinib能夠顯著降低轉移細胞的數量和頭部腫瘤直徑，說明這兩種藥物顯著減弱了腫瘤細胞的侵襲和轉移。以上結果預示著斑馬魚模型可以用于侵襲性疾病的治療研究。

2.2 基因突變RB斑馬魚模型

Gyda等[27]報道了一種自發性rb1基因突變的斑馬魚。他們首先對基因突變斑馬魚使用PCR方法進行基因序列分析，然后用染料DiI 或DiO對視網膜神經節細胞進行標記，接著通過免疫組織化學方法判斷視網膜神經節細胞在細胞周期中的延遲情況。由于視網膜神經節細胞中可以表達GFP熒光，因而通過共聚焦顯微鏡觀察視網膜構造軌跡，可以推斷出軸突發展的情況。通常情況下，新生野生型斑馬魚胚胎視網膜神經節細胞的軸突先于視網膜引背蓋形成，而本研究結果顯示rb1突變后的斑馬魚，視網膜神經節細胞分化周期出現了延遲，導致視網膜神經節細胞短暫不足，進一步導致視網膜神經節細胞的軸突缺陷，從而引發視網膜連接異常和趨勢行為缺陷，使視神經發育不全。盡管 rb1突變的斑馬魚，能夠最終建立基本的網膜連接，但是行為學分析表明，這些發生了rb1突變體的斑馬魚表現出明顯的視覺行為障礙。該研究表明這種罕見的rb1基因突變的斑馬魚會形成RB模型，從一種新的視角建立了一種 rb1基因的功能通路。

2.3 TALEN基因編輯RB斑馬魚模型

Solin等[28]使用TALEN基因編輯法構建RB斑馬魚模型，具體方法是：將靶向rb1基因外顯子2和3的TALEN mRNA注入胚胎，經過編輯的部分斑馬魚胚胎，在3.5個月時開始生長腫瘤。研究者先通過組織病理學染色對不同的腫瘤進行特點分析，進一步通過免疫組織化學法對腫瘤進行鑒定。結果顯示腫瘤發生部位不同，主要出現在大腦中并非視網膜，表現出了神經外胚層樣和膠質樣腫瘤的特征。該研究驗證了斑馬魚 rb1失活會導致癌癥，突出了位點特異性核酸酶對于創建基因嵌合斑馬魚的作用，便于研究癌癥中的 rb1功能。

Zhang等[29]使用TALEN基因編輯法建立了RB斑馬魚模型, 用于研究 rb1在T細胞發展過程中的作用機制。他們開發的TALEN mRNA能夠高效的靶向rb1基因的外顯子2，注射入斑馬魚胚胎后導致了F0代80%的等位基因丟失，F1代中得到了缺乏rb1蛋白的突變體。研究表明rb1基因通過抑制E2F1保護T細胞成熟免于過早凋亡。此外，Schultz等[30]也使用TALEN基因編輯法制作斑馬魚模型，并進一步選用誘導產生的大腦腫瘤用于研究，研究表明表觀遺傳調控因子Rbbp4和Hdac1在斑馬魚rb1胚胎腦腫瘤模型中過表達，是神經祖細胞生存和增殖所必需的。

3 小結

由于我國仍然面臨RB疾病較低的治愈率和生存率，對于RB疾病的治療仍有很大的瓶頸，藥物的研發與評價顯得尤為重要，而斑馬魚作為新型RB模型為藥物研發與評價提供了新的選擇和思路。斑馬魚的選擇能夠大大提高藥物研發與評價工作效率, 因此斑馬魚應用于RB模型中有極大的競爭力。

從以上內容可以看出： ①異種移植法構建原位RB斑馬魚模型，優于其他方法，且操作可行性較高，能夠獲得確切目標的腫瘤模型，評價指標簡便; 使用熒光染色等方法能夠活體監測腫瘤，有利于進一步用于藥物篩選研究。但是在腫瘤發生機制等研究中沒有進行深入研究。②基因突變法構建腫瘤模型，揭示了rb1在調節視網膜神經節細胞軸突和視覺行為中的新作用，為鑒定難以捉摸的RB細胞起源提供新的潛力，但是基因突變極少數能獲得RB斑馬魚模型，需要進一步研究其機制，此方法目前不適用于RB斑馬魚模型的構建。③TALEN基因編輯法構建腫瘤模型，成瘤不確定，在動物機體內多個部位成瘤，但在視網膜未獲得腫瘤，需要進一步研究其機制，不適用于RB斑馬魚模型的構建，但是研究證明了使用基因編輯核酸酶有助于快速大規模篩選斑馬魚中腫瘤抑制因子。

綜上所述，RB斑馬魚模型可以為開發防治RB藥物的成藥性評價提供關鍵支撐，有助于推進一線治療藥物的轉化。同時RB斑馬魚模型的研究工作可以為RB的侵襲、轉移及發病機理提供新見解，有助于推進標準化動物模型并建立相應治療方法。此外, 從實驗動物福利和3R原則角度來看, 斑馬魚模型作為低等動物能更好替代高等動物, 有利于對斑馬魚模型進行深入研究，建立更好模型評價標準和藥物標準。然而目前RB斑馬魚模型研究尚剛剛起步，異體移植的方法相對比較成功的建立模型和評價指標, TALEN方法操作較為復雜, 模型構建的成功率不是很高, 仍需要進一步深入研究。目前最新的基因編輯技術CRISPR/Cas9還未有用于建立RB斑馬魚模型的研究報道, 但我們相信該技術將在基因修飾RB斑馬魚模型的制備及研究中發揮作用。