未知茵的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究

王薪 龔維瑤 陳宜濤 林美愛

摘要：在活化培養(yǎng)放線菌A45時，發(fā)現(xiàn)原平板上放線菌有被抑制現(xiàn)象，通過進(jìn)一步分離培養(yǎng)及接種，確定其確有抑制放線菌A45的能力。為了研究該菌的抑菌效果，通過有機(jī)試劑乙酸乙酯萃取該菌發(fā)酵液，制備濾紙片，發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵液對甲型副傷寒桿菌和表皮葡萄球菌抑菌能力較好。通過微量肉湯稀釋法測定其最低抑菌濃度，可得該菌產(chǎn)生的抑菌成分對表皮葡萄球菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為8mg/mL，對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌濃度為16mg/mL。最后通過薄層層析最佳流動相的測定探索出兩個較好的系統(tǒng)，分別為甲醇：正丁醇：冰乙酸：蒸餾水=9：7：1：2（體積），正丁醇：乙醇：蒸餾水=3：7：7（體積）。

關(guān)鍵詞：未知菌;抑菌活性;最低抑菌濃度;分離系統(tǒng)

中圖分類號：Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-2945（2019）12-0056-03

本研究基于學(xué)生實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象進(jìn)行進(jìn)一步主動探索。由于該菌可生長在放線菌A45平板中，暫認(rèn)為該菌與放線菌A45需相同的生活環(huán)境。對于在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的新菌種，如能及時采取對其的純化培養(yǎng)和確認(rèn)，可能會對以后的實(shí)驗(yàn)及研發(fā)帶來有利影響。但該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)停留在實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究層面，還需進(jìn)一步進(jìn)行PCR測序?qū)嶒?yàn)，確定該菌真實(shí)身份。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1試劑

三氯甲烷（浙江迪耳藥業(yè)有限公司）、乙酸乙酯（華東醫(yī)藥股份有限公司）、石油醚、正丁醇（成都市科龍化工試劑廠）、牛肉膏（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品）、蛋白胨（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、氯化鈉（上海試四赫維化工有限公司）、瓊脂（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、可溶性淀粉（南京化學(xué)試劑有限公司）、硝酸鉀（無錫市東晶化學(xué)試劑有限公司）、磷酸氫二鉀（西隴化工股份有限公司）、七水硫酸鎂（無錫市佳妮化工有限公司）、七水硫酸亞鐵（巨化集團(tuán)公司試劑廠）。

1.2儀器

精密電子天平（型號：PB203-N，梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司）;4℃冰箱（BCD-205E/Y，海爾集團(tuán)）;蘇泊爾微電磁爐（型號：C19A01-A，浙江蘇泊爾股份有限公司）;智能生化培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器）;振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）;立式壓力蒸汽滅菌器（型號：YXQ-LS，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9240A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;無菌操作臺（型號：JB-VS-840U，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）;精密試紙（pH 6.4-8.0，上海三愛思試劑有限公司）;可調(diào)微量鎖緊移液器（型號：WKYⅣ-5，上海佳音分析儀器廠）;燒杯（50mL、100mL、500mL、1000mL和2000mL）;量筒（50mL、100mL、250mL和1000mL）;錐形瓶（100mL、250mL和500mL）;分液漏斗（250mL）;10mL移液管;紗布;微量移液器和槍頭（20lxL，200uL和1000uL）;接種環(huán);酒精燈;脫脂酒精棉;培養(yǎng)皿;玻璃棒。

1.3培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCI5g/L，瓊脂18g/L，pH 7.4-7.6。

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g/L，KN03 1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4-7H2O 0.5g/L，NaCI 0.5g/L，F(xiàn)eSO4-7H2O 0.mg/L，瓊脂18g/L，pH 7.4-7.6。

液體培養(yǎng)基均是上述配方不加瓊脂。

1.4菌種

放線菌A45，枯草芽孢桿菌，甲型副傷寒桿菌，大腸桿菌，表皮葡萄球菌，傷寒桿菌，痢疾桿菌，金黃色葡萄球菌（均由本實(shí)驗(yàn)室保存）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1未知菌株的發(fā)現(xiàn)

無菌條件下，培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)室保存的放線菌A45，從中挑取未知菌種進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，挑取純化的單個菌落，點(diǎn)在密集劃線的正常放線菌A45平板上，放培養(yǎng)箱28℃倒置培養(yǎng)48h觀察。

2.2未知菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

無菌條件下，挑取未知菌株單個菌落接種于高氏一號培養(yǎng)液，置于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)以200r/min 28℃振蕩培養(yǎng)4d。待大部分孢子成熟后，即可用于發(fā)酵培養(yǎng)。按照8%（20mL）的接菌量接種于新的高氏一號培養(yǎng)液中，置于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)以200r/min 28℃振蕩培養(yǎng)4d。

2.3抑菌活性物質(zhì)的萃取濃縮

將澄清的發(fā)酵液用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。加入1/4體積的有機(jī)溶劑，充分?jǐn)嚢韬箪o置4h，收集有機(jī)相和水相，用濾紙片法檢測各相萃取液的抑菌活性，將有活性相萃取三次后分別合并。將合并相于70℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4活性物質(zhì)的抑菌實(shí)驗(yàn)

2.4.1濾紙片法

無菌條件下，用無菌鑷子夾取直徑為5mm的圓形無菌濾紙片分別放入需檢測的溶液中，充分浸泡，2h后取出無菌風(fēng)干，備用。將活化好的供試菌株密集劃線接種于無菌平板上，用鑷子夾取風(fēng)干的濾紙片放在接種的平板上。放入培養(yǎng)箱。37℃倒置培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

2.4.2微量肉湯稀釋法

無菌操作，將制備的濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)肉湯1：1000稀釋后分別加到無菌96孔聚苯乙烯板中的第1-11孔，每孔中加180ul。將不同濃度梯度的粗提物溶液分別加到上述1-10孔中，每孔20ul，第11孔不加粗提物作為生長對照。使第1-11孔最終粗提物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0mg/ml，將96孔板密封后置35～C普通空氣孵育箱中，孵育24h，用酶標(biāo)儀在630nm處檢查吸光度值，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.5抑菌成分分離

展層劑于展層缸中飽和。毛細(xì)管將樣品點(diǎn)樣到薄層層析硅膠板上，點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑不超過2mm，單次點(diǎn)樣，樣點(diǎn)距薄層一端約1cm。將硅膠板放入已飽和的層析缸中展開，當(dāng)展層溶劑上行到距硅膠板另一端邊緣1cm處時取出，放置于空氣中自然干燥，紫外燈下觀察其條帶情況。通過選取不同展層劑對樣品進(jìn)行分離，確定樣品的最適展開條件。