鍍鎳多壁碳納米管對序批式反應器性能及其微生物群落的影響?

高 峰， 馬丙瑞， 李姍姍， 于娜玲， 趙長坤， 李志偉， 高孟春??

(1. 中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室，山東 青島 266100； 2. 中國海洋大學環境科學與工程學院，山東 青島 266100)

多壁碳納米管(Multi-walled Carbon Nanotubes，簡稱MWCNTs)因其獨特的一維納米結構以及優良的力學、電學和化學性能，被廣泛地應用于材料工業、電子工業、環保及能源工業、生物醫藥和催化劑等領域[1-3]。MWCNTs的廣泛應用，不可避免地會在生產、使用和廢棄過程中釋放到環境中去，從而增加了人、動物和植物與MWCNTs的接觸機會，其潛在的環境效應和生態風險已經引起了人們的廣泛關注。大量關于MWCNTs毒理學的研究結果表明[4-7]，MWCNTs能穿過細胞壁和細胞膜進入生命體，進而對人體器官、動物、植物和微生物等產生明顯的毒性效應。進入環境中的MWCNTs可通過在土壤、水和空氣等環境介質中遷移而進入水環境，最終出現在污水生物處理系統中。Gottschalk等[8-9]模擬了CNTs在污水和污泥中的濃度，預測其濃度在μg/L水平上。同時隨著MWCNTs的大規模生產和應用，不可避免地會通過各種途徑被釋放到環境中，進而導致環境中的MWCNTs濃度不斷升高。

鑒于MWCNTs具有較強的生態毒性效應，隨著活性污泥中富集的MWCNTs不斷增加，可能會對活性污泥中的微生物活性及其群落結構產生影響，進而影響其對污水中有機物、氮和磷等的去除效果。Luongo和Zhang[10]報道了MWCNTs能夠抑制活性污泥的呼吸活性，且抑制作用呈明顯的濃度-效應關系。Zheng等[11]研究發現，0～100 mg/L MWCNTs的短期暴露對序批式反應器(Sequencing Batch Reactor，簡稱SBR)的脫氮除磷性能和活性污泥中的微生物活性無明顯影響。Hai等[12]發現1和20 mg/L MWCNTs的短期暴露未對SBR的脫氮除磷性能產生影響，然而20 mg/L MWCNTs的長期作用明顯抑制了SBR對COD、氮和磷的去除效果。

鍍鎳碳納米管(Ni coated multi-walled carbon nanotubes，簡稱MWCNTs-Ni)是指將原始MWCNTs進行純化、敏化和活化預處理，然后利用化學鍍鎳的方法在其表面沉積一層金屬鎳而制備出的功能化多壁碳納米管[13]。相較于原始MWCNTs，MWCNTs-Ni在分散性、抗蝕性、電磁性能及微波吸收性能等方面均得到改善，從而大大拓寬了MWCNTs在各領域中的應用[13-14]。高的分散性使得MWCNTs-Ni更易于分散在水環境中，并通過遷移轉化最終出現在污水生物處理系統中。然而，關于長期暴露條件下MWCNTs-Ni對污水生物處理系統性能及其微生物群落影響的研究未見報道。根據以往的研究報道[10-12]，本研究選用MWCNTs-Ni濃度為10 mg/L，研究了了長期暴露條件下MWCNTs-Ni對SBR性能、微生物酶活性和微生物群落的影響；通過活性氧(Reactive oxygen species，簡稱ROS)產生量和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，簡稱LDH)釋放量的變化情況評價了MWCNTs-Ni的長期暴露對活性污泥的生物毒性。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置及運行條件

SBR實驗裝置如圖1所示。反應器采用有機玻璃材質，有效高度為50 cm，內徑為14 cm，有效容積為7.7 L。通過蠕動泵從SBR底部進水，在反應器中部設置出水閥，通過電磁閥控制排水，容積交換率為50%。SBR每日運行3個周期，每個周期8 h，通過時間繼電器進行自動調控，具體運行參數如下：進水階段0.1 h，缺氧階段2.8 h，好氧階段3 h，沉淀階段0.5 h，排水階段0.1 h，閑置階段1.5 h。除了沉淀、排水和閑置階段，磁力攪拌器一直運行，確保污泥和污水充分混合。SBR采用底部曝氣方式，空氣壓縮機通過砂芯曝氣頭從反應器底部通入空氣，并使用氣體轉子流量計調節曝氣量，維持好氧階段的溶解氧在2 mg/L以上。在好氧階段結束前，排出一定量的污泥，保證系統的除磷效果，同時使污泥齡保持在20 d左右。

1.2 接種污泥和進水水質

圖1 SBR示意圖Fig. 1 Schematic diagram of SBR

1.3 MWCNTs-Ni儲備液配制

本試驗所用的MWCNTs-Ni購于中國科學院成都有機化學有限公司，具體參數如下：純度>98%，長度50 μm，內徑3～5 nm，外徑8～15 nm。MWCNTs-Ni儲備液的配制方法如下[15]：稱取0.5 g MWCNTs-Ni粉末，干燥滅菌后在超凈臺中冷卻，加入1 L經0.22 μm濾膜滅菌的Milli-Q水，用磁力攪拌器攪拌30 min后超聲1 h(25 ℃，250 W，40 kHz)，隨后在25 ℃，150 r·min-1的條件下放置1夜。在每次配制進水前，先將儲備液超聲1 h以打碎MWCNTs-Ni聚集體。

1.4 分析方法

2 結果與討論

2.1 MWCNTs-Ni對SBR性能的影響

圖2 MWCNTs-Ni對SBR去除性能的影響Fig. 2 Effects of MWCNTs-Ni on the SBR performance

2.2 MWCNTs-Ni對活性污泥SOUR和脫氮速率的影響

2.3 MWCNTs-Ni對活性污泥中酶活性的影響

DHA在有機物降解過程中起關鍵作用[18]，長期暴露條件下MWCNTs-Ni對活性污泥中DHA活性的影響如圖4所示。與進水中未加入MWCNTs-Ni時的第32天相比，活性污泥中DHA活性在第71天時未發生明顯變化，而隨著SBR繼續運行至第148天，DHA由第32天時的(15.26±0.57) mg TF/(g MLVSS·h)降至(11.55±0.57) mg TF/(g MLVSS·h)，降低了24.32%(p<0.05)，表明MWCNTs-Ni的長期暴露能夠抑制SBR活性污泥中DHA活性。

(“*”表示該樣品與進水MWCNTs-Ni濃度為0 mg/L時的SOUR和脫氮速率差異性顯著(p<0.05). Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from SOUR and nitrogen removal rates at 0 mg/L MWCNTs-Ni.)

圖3 MWCNTs-Ni對活性污泥SOUR和脫氮速率的影響
Fig. 3 Effects of MWCNTs-Ni on the SOUR and nitrogen removal rates of activated sludge

(“*”表示該樣品與進水MWCNTs-Ni濃度為0 mg/L時的微生物酶活性差異性顯著(p<0.05)。 Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from the microbial enzymatic activity at 0 mg/L MWCNTs-Ni.)

圖4 MWCNTs-Ni對微生物酶活性的影響
Fig. 4 Effects of MWCNTs-Ni on the microbial enzymatic activity of activated sludge

2.4 MWCNTs-Ni對活性污泥的生物毒性影響

ROS的產生量和LDH的釋放量是反映細胞氧化應激水平和細胞膜完整性的重要指標，因此本實驗通過測定活性污泥ROS的產生量和LDH的釋放量來評價MWCNTs-Ni的長期暴露對活性污泥的生物毒性影響。如圖5所示，與進水中未加入MWCNTs-Ni時的第32天相比，活性污泥ROS產生量在第71天、108天和148天時分別增加了24.66%、47.53%和67.23%。上述研究結果表明，MWCNTs-Ni(“*”表示該樣品與進水MWCNTs-Ni濃度為0 mg/L的樣品差異性顯著(p<0.05)。 Asterisks indicate statistical differences (p<0.05) from the ROS production and LDH release at 0 mg/L MWCNTs-Ni)的長期暴露能夠誘導ROS產生，過量的ROS會打破細胞氧化過程及抗氧化過程的平衡，從而對活性污泥中的微生物造成氧化性損傷[20-21]。活性污泥LDH的釋放量隨SBR運行時間的延長而逐漸增加，與進水中未加入MWCNTs-Ni時的第32天相比，LDH的釋放量在第148天時增加了65.33%，表明MWCNTs-Ni能夠誘導活性污泥中微生物產生嚴重的細胞膜損傷。

圖5 MWCNTs-Ni對活性污泥ROS相對產生量和LDH相對釋放量的影響Fig. 5 Effect of MWCNTs-Ni on the relative ROSproduction and LDH release of activated sludge

2.5 MWCNTs-Ni對活性污泥中微生物群落的影響

表1表示不同運行時間條件下微生物群落的豐富度和多樣性指數。在第32、71、108和148天時，將測序得到的有效序列以97%的一致性進行OTUs聚類分析，分別獲得645、634、584和527個OTUs。SBR中活性污泥樣品的Good’s coverage在第32、71、108和148天時為0.999，表明測序結果涵蓋了樣品中絕大部分物種，能夠準確地反映微生物群落豐富度和多樣性。Chao1和ACE指數能夠表征微生物群落的豐富度，而Shannon和Simpson指數能夠表征微生物群落的多樣性[22]。Chao1和ACE指數值越大，說明群落豐富度越高；Shannon和Simpson指數值越大，說明群落多樣性越高。隨著SBR由第32天運行至第148天，Chao1和ACE指數分別從643.7和652.3降至516.6和521.2，Shannon和Simpson指數分別從6.914和0.973降至5.436和0.887，表明MWCNTs-Ni的長期暴露降低了SBR中微生物群落的豐富度和多樣性。

表1 不同運行時間條件下微生物群落的豐富度和多樣性指數Table 1 Richness and diversity indices of microbial community at different operation times

圖6表示不同運行時間條件下微生物群落在門和屬水平上的分類。在進水中未加入MWCNTs-Ni的第32天，活性污泥微生物群落中豐度最大的菌門Proteobacteria，占總群落的40.91%；其次為Bacteroidetes，占總群落的28.35%。隨著SBR逐漸運行至第148天，Bacteroidetes的相對豐度逐漸增至49.17%，顯示出較好的MWCNTs-Ni耐受能力；而Proteobacteria的相對豐度逐漸降至33.71%。Proteobacteria中包含許多與脫氮除磷過程相關的菌屬，在氮、磷的去除過程中發揮著重要作用，Proteobacteria相對豐度的降低可能是SBR對氮去除效果降低的原因。此外，Chloroflexi、Ignavibacteriae、Chlorobi、Acidobacteria、Planctomycetes((a)門水平；(b)屬水平(a) phyla level and (b) genus levels.) 和Actinobacteria等菌門的相對豐度也隨MWCNTs-Ni暴露時間的延長而呈降低趨勢。當SBR運行至第148天時，亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas、亞硝化螺菌屬Nitrosospira和硝化螺菌屬Nitrospira的相對豐度分別由未加入MWCNTs-Ni時的1.19%、0.27%和0.59%降至0.24%、0.09%和0.25%。在污水處理過程中，Nitrosomonas和Nitrosospira是兩種主要的氨氧化細菌，能夠將氨氮氧化成亞硝氮[23]；而Nitrospira是一種主要的亞硝酸鹽氧化細菌，能夠將亞硝氮氧化成硝氮[24]。在不同時間條件下的4個污泥樣品中共觀察到5種反硝化菌屬：Dokdonella、Dechloromonas、Steroidobacter、Devosia和Thermomonas，它們能夠在好氧或者厭氧條件下還原硝氮或者亞硝氮[25-29]。當SBR運行至第148天時，Dokdonella、Dechloromonas、Steroidobacter、Devosia和Thermomonas的相對豐度分別從第32天時的3.46%、1.84%、0.71%、0.39%和0.39%降至0.71%、0.25%、0.22%、0.19%和0.11%。上述結果表明，MWCNTs-Ni的長期暴露明顯降低了活性污泥中與硝化過程及反硝化過程相關的微生物群落的相對豐度，進而影響到SBR對氮的去除。隨著SBR由第32天運行至第148天，Flexibacter、Sediminibacterium、Ignavibacterium、Levilinea、Terrimonas、Methylosinus、Planctomyces和Flavobacterium等菌屬的相對豐度逐漸降低；而Candidatus_Competibacter、Haliscomenobacter、Anaerolinea、Owenweeksia和Lewinella的相對豐度分別從17.33%、9.77%、1.35%、0.43%和0.15%增至23.19%、33.62%、2.14%、2.26%和3.97%，表明MWCNTs-Ni的長期暴露使得活性污泥中的微生物群落結構發生明顯變化。

((a)門水平；(b)屬水平。(a) Phyla level; (b) Genus levels.)

3 結論

(2)與進水中未加入MWCNTs-Ni時的第32天相比，活性污泥SOUR和DHA活性在第148天時分別降低了17.43%和24.32%；而脫氮速率和與脫氮相關的微生物酶活性均降低了60%以上，從而導致SBR對氮的去除效果明顯降低。

(3)MWCNTs-Ni的長期暴露導致活性污泥ROS產生量和LDH釋放量在第148 天時分別增加了67.23%和65.33%，表明MWCNTs-Ni的長期暴露能夠誘導活性污泥中微生物產生氧化應激和細胞膜損傷。

(4)高通量測序結果表明長期暴露于10 mg/L的MWCNTs-Ni條件下，活性污泥中與硝化過程相關菌屬和與反硝化過程相關菌屬的相對豐度明顯降低，進而影響到SBR對氮的去除。