蕨麻多酚對血管內皮細胞糖氧剝奪損傷的改善作用研究*

陳 曄 ，劉 丹 ，李靈芝 ，3△，張永亮 ，李建宇 ，金 鑫

（1.武警后勤學院軍事藥學教研室，天津 300309； 2.武警北京總隊醫院藥劑科，北京 100000；3.天津市職業與環境危害防制重點實驗室，天津 300309； 4.武警后勤學院職業教育中心，天津 300309）

高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發生、發展與慢性氧化應激的增加密切相關[1]。內皮細胞為接觸血液的第一層細胞，需應對各種病理和生理挑戰，如氧張力不足等[2]。缺氧會引起細胞內活性氧富集，自由基代謝紊亂，使細胞內氧化還原反應失衡，最終導致細胞凋亡。因此，對抗低氧誘導的血管內皮細胞損傷對于心血管疾病的治療具有重要意義。蕨麻是薔薇科委陵菜屬植物鵝絨委陵菜的干燥膨大塊根，具有耐缺氧、抗應激、抗氧化、補血和保護心肌細胞等活性[3]。其主要含有黃酮類、萜類、多酚類化合物[4]，其中咖啡酸、丁香酸、短葉蘇木酚等多酚化合物具有抗氧化、抗內毒素及保肝等藥理作用[5-8]。本研究中通過建立EA.hy926內皮細胞糖氧剝奪模型，探討蕨麻多酚的抗缺氧損傷作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株、儀器與試藥

細胞株：人臍靜脈血管內皮細胞（EA.hy926，北京醫科大學腫瘤研究所）。

儀器：371型CO2培養箱、3111型混合氣體培養箱（美國Thermo Fisher公司）；Cytation 5型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；UV-1800型紫外分光光度儀（日本Shimadzu公司）；MJ Research PTC-200型聚合酶鏈反應儀（美國MJ Research公司）；Eppendorf 22331型核酸定量儀（德國Eppendorf公司）；成像分析系統（Gel Pro 4.5工作站）；IX71型光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：蕨麻多酚由天津武警后勤學院軍事藥學教研室高原醫學實驗室自制；復方丹參滴丸（天津天士力制藥有限公司，批號為20151202，規格為每丸27mg）；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批 號分別為 20140320，20140521，20140602，20161204）；內皮素 -1（ET-1）試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Trizol Reagen（美國Invitrogen公司）；逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（美國 Promega公司）；四氮唑鹽（MTT，美國 Sigma公司）；胎牛血清（美國MRC公司）；DMEM培養液（北京索萊寶科技有限公司）；D-Hank′s溶液（天津武警后勤學院軍事藥學教研室高原醫學實驗室配制）。

1.2 方法

內皮細胞培養：將EA.hy926內皮細胞接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，于37℃及5%CO2條件下培養，待細胞生長密度達80% ～90%時，消化傳代備用。

分組、給藥及模型建立：取對數生長期細胞，用無血清的DMEM培養液培養24 h后分組，試驗分為正常對照組（A組，DMEM培養液），模型組（B組，缺氧的DHank′s溶液），復方丹參滴丸組（C 組，2.4 g／L+ 缺氧的D-Hank′s溶液），蕨麻多酚高、中、低質量濃度組（D1組，2.4 g／L；D2組，1.2 g／L；D3組，0.6 g／L；分別加缺氧的D-Hank′s溶液）。A組細胞置5%CO2培養箱中培養，其余組細胞置5%CO2-95%N2的三氣培養箱中缺氧培養2 h。

HE染色：取出單層細胞爬片的蓋玻片，行HE染色，用中性樹膠封片，于200倍顯微鏡下觀察拍照。

1.3 觀察指標

細胞活力：采用MTT試驗將細胞消化計數，以5×103個／孔的密度接種于細胞培養板。按1.2項下方法操作，避光加20 μL MTT，置5%CO2培養箱中孵育4 h。棄上清，每孔加150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使藍紫色結晶充分溶解，采用紫外分光光度儀測定吸光度（OD）值并計算細胞活力。細胞活力=（OD用藥組-ODA組）／（ODB組-ODA組）。

LDH、NO及ET-1水平：將細胞消化計數，以8×103個／孔的密度接種于細胞培養板。按1.2項下方法操作，取上清液，1 000 r／min離心5 min，收集上清液，采用分光光度法測定LDH和NO水平，采用放射免疫法測定ET-1水平。

SOD及 MDA水平：將細胞消化計數，以 8×103個／孔的密度接種于細胞培養板。按1.2項下方法操作，用胰蛋白酶消化、離心、收集細胞。加1mL磷酸鹽緩沖液（PBS），超聲破碎細胞。采用BCA法測定蛋白濃度，采用分光光度法測定SOD和MDA水平，并計算SOD／MDA。

內皮型一氧化氮合酶（eNOS）及ET-1 mRNA表達水平：將內皮細胞接種于6孔板，待細胞長滿后，按1.2項下方法操作，以D-Hank′s溶液洗滌細胞，Trizol法提取RNA，鑒定RNA純度和完整性后，反轉錄制備cDNA，以 β-actin引物為內參。eNOS上游為5′-GCACA GGAAATGTTCACCTAC-3′，下游為 5′-GTATCCAGGT CCATGCAGAC-3′，擴增長度為 551 bP；ET-1 上游為5′-TTCTCTCTGCTGTTTGTGG-3′，下游為 5′-CAATGTGCTCGGTT GTG-3′，擴增長度為 614 bP；β-actin 上游為 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游為 5′-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴 增長度為547 bP。PCR 擴增反應條件為 94℃ 45 s，62℃ 45 s，72℃30 s，循環28次。擴增反應完成后，以1.5%瓊脂糖凝膠、PCR 產物 5 μL，加 6×loading buffer 2 μL 混合上樣，50 V電泳60 min。利用圖像分析系統分析各條帶光密度值，以 β-actin表達量為對照，計算各基因的相對表達量。

1.4 統計學處理

采用SPSS22.0統計學軟件分析。計量資料以表示，行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色

A組細胞間聯接密切，細胞間隙較小，胞漿飽滿，呈紅染，細胞核大，呈藍染。B組細胞間隙略增大，胞漿紅染變淺，細胞核固縮，呈深藍染。與B組比較，C組及D1組細胞形態接近正常細胞形態。詳見圖 1。

圖1 內皮細胞形態學（HE，×200）

2.2 細胞活力、LDH、NO和ET-1水平

與A組比較，B組細胞活力顯著減弱，LDH活性顯著增強，NO含量顯著減少，ET-1顯著增加（P＜0.01）。與B組比較，C組、D1組、D2組細胞活力均顯著增強（P＜0.01），C組、D1組、D2組、D3組LDH活性均顯著減弱，NO含量顯著增加，ET-1含量顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），且LDH和NO變化呈量效依賴關系。詳見表 1。

表1 6組內皮細胞活力與LDH、NO、ET-1水平比較（± s，n=6）

表1 6組內皮細胞活力與LDH、NO、ET-1水平比較（± s，n=6）

注：與A組比較，##P＜0.01；與 B組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。表2和圖2同。

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2.3 SOD和MDA水平

與A組比較，B組SOD活性顯著減弱，MDA含量顯著增加，SOD／MDA顯著下降（P＜0.01）；與B組比較，D1組、D2組、D3組SOD活性顯著增強（P＜0.01或P＜0.05），C 組、D1組、D2組、D3組 MDA 含量顯著減少，SOD／MDA顯著升高（P＜0.01）。詳見表 2。

表2 6組內皮細胞SOD及MDA水平比較（± s，n=6）

表2 6組內皮細胞SOD及MDA水平比較（± s，n=6）

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2.4 eNOS mRNA和ET-1 mRNA表達水平

與A組比較，B組eNOS mRNA表達水平顯著降低，ET-1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）；與B組比較，D1組和D2組eNOS mRNA表達水平均顯著升高，C組、D1組、D2組ET-1 mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.01）。詳見圖 2。

圖2 6組內皮細胞中eNOSmRNA和ET-1mRNA表達水平比較

3 討論

本課題組前期已建立起人臍靜脈血管內皮細胞（EA.hy926）糖氧剝奪模型，在缺氧2 h后細胞活力顯著降低，LDH漏出量顯著增加，細胞存活率降至28%[9]，說明糖氧剝奪2 h已對內皮細胞造成嚴重損傷，因此本研究中選定內皮細胞缺氧時間為2 h。復方丹參滴丸是廣泛應用于治療心腦血管疾病的中成藥，通過減少過氧化物生成、增加NO合成、減少ET-1合成來發揮保護內皮細胞的作用[10-11]，故本研究中選用其為陽性對照藥物。試驗結果顯示，加入復方丹參滴丸有效成分后，與B組比較，細胞活力顯著增強，NO合成顯著增加，ET-1 mRNA表達水平及釋放量均顯著降低，與許晶蘭等[11]的研究結果一致。

正常生理條件下機體內自由基的產生和抗氧化酶對自由基的清除處于動態平衡狀態。SOD是機體產生的抗氧化酶之一，能清除機體在正常生理狀態下產生的氧自由基。SOD活性與反映機體的自由基清除能力呈正相關[12]。臨床還將MDA視為與SOD相互匹配的指標。作為脂質過氧化的產物，MDA可引起細胞腫脹，最終導致細胞膜破裂[13]。因此，MDA含量不僅反映自由基引起細胞受損的程度，同時也反映細胞脂質過氧化的嚴重程度。SOD／MDA能較客觀地反映機體清除自由基的速率和自由基引起脂質過氧化水平[14]。LDH是一種糖酵解酶，是反映細胞膜完整性的敏感指標。本試驗中，內皮細胞糖氧剝奪2 h后，B組細胞內SOD活性顯著減弱，MDA含量顯著增加，SOD／MDA顯著降低，而LDH釋放量顯著增加，表明缺氧2 h已引起內皮細胞內氧化還原反應失衡，自由基堆積導致的細胞膜脂質過氧化損傷已引起細胞損傷；加入蕨麻多酚后細胞內SOD活性顯著增強，MDA含量顯著減少，SOD／MDA顯著升高，同時LDH釋放量顯著減少，表明蕨麻多酚能對抗缺氧缺糖引起的內皮細胞氧化還原失衡，減輕自由基堆積誘導的內皮細胞過氧化損傷。

作為內源性舒張血管的活性物質，NO水平改變可導致動脈粥樣硬化和心血管疾病。eNOS在正常內皮細胞中，eNOS能催化氧化L-精氨酸產生NO，以維持正常的心血管收縮功能，eNOS適當表達可維持血管壁功能，它反映了向周圍組織器官供血的敏感程度和有效程度。缺氧下調了eNOS mRNA的表達，減少內皮細胞中NO生成，導致血管收縮和血栓形成[15]。本研究中，B組細胞中eNOS mRNA表達水平顯著降低，NO含量顯著減少；蕨麻多酚干預后，模型細胞eNOS mRNA表達水平顯著升高，NO含量顯著增加，表明蕨麻多酚能上調缺氧狀態下eNOS mRNA的表達水平，促進NO的合成與釋放，從而發揮保護內皮細胞的作用。ET-1是長效強血管收縮物質，能調節血管收縮和血壓，參與高血壓和其他多種心血管疾病的發生。缺氧／缺血能激活低氧誘導因子HIF-1α，進而上調ET-1的表達，最終導致血管收縮，血液流速降低[16]。本研究中，糖氧剝奪導致內皮細胞ET-1 mRNA表達水平顯著升高，蕨麻多酚干預后細胞內ET-1 mRNA表達顯著降低，表明蕨麻多酚能抑制糖氧剝奪引起的ET-1升高。

綜上所述，蕨麻多酚對內皮細胞糖氧剝奪損傷具有明顯的保護作用，其機制可能與對抗細胞內氧化應激失衡和維持NO與ET-1間的動態平衡有關。