舒洛地特原料藥安全性檢查法研究

張 娟，魏 霞，李水仙，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101）

舒洛地特有抗血栓、降低血黏度、調血脂、減少血小板聚集、保護腎臟等作用，屬多組分生化藥物，有多種生物活性，用于治療有血栓形成危險的血管性疾病及糖尿病腎病。為保證其用藥安全性，提高藥品質量，應做好原料藥的安全性檢查，但現行的2015年版《中國藥典》及局頒標準均未收載舒洛地特。本研究中對舒洛地特的過敏反應、降壓物質和異常毒性檢查方法學進行探討，確定限值，為制訂其質量標準提供依據?，F報道如下。

1 動物、儀器與試藥

1.1 動物

ICR小鼠75只，SPF級，體質量18～22 g，雌雄各半，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產許可證號為SCXK（魯）20140007；Hartley豚鼠42只，普通級，體質量250～350 g，雌雄各半，購自濟南金豐實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（魯）20140006；貓1只，體質量3.5 kg，雄性，購自市場。飼養條件：小鼠飼養于屏障級動物實驗室，豚鼠和貓飼養于普通級動物實驗室，使用許可證號均為SYXK（魯）20130012。溫度20～25℃，日溫差≤3℃；相對濕度40% ～70%；每1 h換氣次數不少于10次；照明12 h，明暗交替。經動物倫理委員會同意后開始試驗。

1.2 儀器

BL-420E型生物機能實驗系統（成都泰盟科技公司，量程為 ±0.5 V ～ ±20 μV）；BSA4202S型電子天平（檢測精度為0.06 mg），CP225D型電子天平（檢測精度為0.01 mg），均購自德國Sartorius公司。

1.3 試藥

舒洛地特（國內某公司。樣品A，批號為DYHSLDT20150501，含量為 12 LSU／mg，干燥失重 1.6%；樣品B，批號為 DYH-SLDT20150502含量為12 LSU／mg，干燥失重2.7%；樣品C，批號為DYH-SLDT20150503，含量為 13 LSU／mg，干燥失重1.0%）；氯化鈉注射液（山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司，批號為16030202，規格為每支 10 mL ∶90 mg）；苯巴比妥鈉注射液（廣東邦民制藥有限公司，批號為130535，規格為每支100 mg）；戊巴比妥鈉（山東西亞化學工業有限公司，批號為05636）；肝素鈉（東營天東制藥有限公司，批號為KH2-1704009，純度為98%）；磷酸組胺（中國食品藥品檢定研究院，批號為150510-201313，規格為每支20 mg）。

2 方法與結果

2.1 過敏反應檢查

限值確定：取豚鼠24只，隨機分為6組，每組4只，雌雄各半，取樣品 C，將其分別配成 1 200，600，300 LSU／mL濃度的供試品溶液，分別腹腔注射和靜脈注射，給藥體積均為1mL，連續觀察7d。按每只豚鼠體質量 300g 計（下同），劑量分別為 4000，2000，1000LSU／kg，相當于普通成人（60 kg，下同）1 d最大劑量的400倍、200倍和100倍。結果，4 000 LSU／kg劑量組豚鼠腹腔注射藥物后出現撓鼻、步態不穩等現象，注射1 d后癥狀消失，其他各組豚鼠均未出現明顯毒性反應，提示豚鼠腹腔注射和靜脈注射舒洛地特的無毒性反應劑量均不超過2 000 LSU／kg。根據致敏和激發劑量應小于豚鼠該途徑的急性毒性反應劑量，激發劑量應大于致敏劑量的指導原則[1]402，本品過敏反應檢查時采用臨床擬用濃度300 LSU／mL的供試品溶液進行致敏和激發。即設定致敏劑量為500 LSU／kg，激發劑量為1 000 LSU／kg。

供試品檢查：取豚鼠18只，雌雄各半，按體質量隨機分為3組，分別對3批樣品進行過敏反應檢查（以300 LSU／mL供試品溶液作為致敏液和激發液），各組豚鼠分別隔日腹腔注射相應致敏液0.5mL，連續注射3次。第1次腹腔注射后14 d每組取3只豚鼠，分別于小隱靜脈注射相應激發液1 mL；第1次腹腔注射后21 d，每組取剩余3只豚鼠，分別于小隱靜脈注射相應激發液1 mL。觀察給藥后30 min內產生的反應。依據2015年版《中國藥典（四部）》通則1147“過敏反應檢查法”判斷結果。結果，豚鼠均未出現豎毛、發抖、干嘔、連續噴嚏（或咳嗽）3聲、紫癜和呼吸困難等現象，也未出現二便失禁、步態不穩或倒地、抽搐、休克、死亡現象[1]159[2]428-429，均為陰性。

2.2 降壓物質檢查[3-4]

貓的靈敏度檢查方法：貓麻醉后固定于保溫手術臺上，分離氣管并插管使呼吸通暢，分離一側頸動脈，插入充滿抗凝劑（1000U／mL的肝素鈉溶液）的動脈插管，插管另一端通過生理壓力傳感器與生物機能試驗系統相連，記錄動物血壓。分離一側股靜脈，插入通過軟管與可調定量加液器相連的靜脈插管，用于注射藥物、組胺并補充氯化鈉注射液[2]335-336。按2015年版《中國藥典（四部）》通則1145“降壓物質檢查法”，首先檢查動物靈敏度，結果符合規定。詳見表 1。

表1 貓靈敏度檢查結果

限值確定：取樣品C，加氯化鈉注射液溶解稀釋，制成濃度為250 LSU／mL的供試品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則1145“降壓物質檢查法”試驗，注射劑量（dT）50 LSU／kg，各次注射速率基本相同。分別記錄給藥前后的血壓值，重復3次，計算藥物引起血壓下降的反應值。結果，50 LSU／kg劑量下動物血壓輕微下降（分別下降 0.70，0.05，0.66 kPa，平均 0.47 kPa）。根據2015年版《中國藥典（四部）》通則9301“注射劑安全性檢查法應用指導原則”[1]401，一般以臨床最大單次用藥劑量的0.2～5.0倍作為降壓反應物質檢查劑量限值，急重病癥盡量采用高限值。考慮到本品臨床最大單次用藥劑量為每天1支（2 mL∶600 LSU），肌肉注射或靜脈注射，連用15～20 d。臨床最大單次用藥劑量的5倍，即為 5×（1×600／60）LSU／kg=50 LSU／kg，因此選用50 LSU／kg的劑量作為檢查限值。

供試品檢查：分別將3批樣品用氯化鈉注射液稀釋成濃度為250 LSU／mL的供試品溶液，dT為50 LSU／kg，磷酸組胺標準品注射劑量（dS）為 0.1 μg／kg，以 dS，dT，dT，dS4個劑量為1組依次注射，記錄反應值。然后以第 1（dS1）與第 3（dT2）、第 2（dT1）與第 4（dS2）劑量所致反應值分別比較，如dT所致反應值均不大于ds所致反應值的50%，即認為供試品的降壓物質檢查符合規定；否則按上述次序繼續注射1組4個劑量（分別用dS1′，dT1′，dT2′，dS2′表示），并按相同方法分別比較兩組內各對ds、dT劑量所致反應值；如dT所致反應值均不大于ds所致反應值，即認為供試品的降壓物質檢查符合規定[1]158[2]336-337。結果3批舒洛地特的降壓物質檢查均符合規定。詳見表 2。

表2 舒洛地特降壓物質檢查結果

2.3 異常毒性檢查

半數致死量（LD50）試驗[5-7]：取小鼠60只，隨機分為6組，每組10只，雌雄各半。取樣品適量，加氯化鈉注射液配制成濃度為2431 LSU／mL的供試品溶液，并按等比級數0.7 稀釋成1701.7，1191.2，833.8，583.7，408.6LSU／mL的系列濃度，分別尾靜脈注射供試品溶液（樣品批號為DYH-SLDT20150503）48 620，34 034，23 844，16 676，11 674，8 172 LSU／kg，注射劑量為 20 mL／kg，注射速率為0.1 mL／s。觀察給藥后72 h內小鼠死亡情況及出現的反應，結果見表 3。Bliss法計算 72 h內LD50。動物死亡數、LD50和LD50可信限結果見表 4。回歸方 程Y（Probit）=-11.105+3.734 4 log（D），LD50=20 534 LSU／kg，LD50（Feiller校正）95% 可信限為15 957 ～ 26 580 LSU／kg。

表3 舒洛地特小鼠急性毒性試驗結果（n=10）

表4 Bliss法計算舒洛地特 LD50結果（n=10）

限值確定：根據2015年版《中國藥典（四部）》通則9301“注射劑安全性檢查法應用指導原則”[1]401，如難以計算出最低致死量，可采用小于LD50可信限下限的1／4（建議采用1／8～1／4）。如LD50與臨床體質量劑量之比小于20，可采用LD50可信限下限的1／4或LD1可信限下限的1／3。舒洛地特臨床體質量最大劑量為10LSU／kg，其LD50與臨床體質量劑量之比為2 053.4倍（大于20）。異常毒性檢查限值可采用小于LD50可信限下限的1／8～1／4，即 1994.6～3989.2LSU／kg。異常毒性限值采用LD50可信限下限的 1／8，即 1994.6LSU／kg（≈2000LSU／kg）。為保證用藥安全，限值可適當嚴格，擬確定舒洛地特異常毒性檢查時采用80 LSU／mL的供試品溶液，每只小鼠靜脈注射給藥0.5 mL，小鼠體質量按20 g計算，劑量相當于2 000 LSU／kg。

供試品檢查：取3批供試品，分別用氯化鈉注射液配制成80 LSU／mL的供試品溶液，根據2015年版《中國藥典（四部）》通則1141，每批供試品取小鼠5只，每只小鼠尾靜脈注射供試品溶液0.5 mL，4～5 s內勻速注射完畢。給藥后48 h內，3組小鼠均未見死亡，表明3批舒洛地特均符合規定[1]153[2]305-306。

3 討論

舒洛地特作為抗血栓藥治療各種心血管疾病，在國外應用已超過20年[8]。其生產工藝過程中有可能污染組胺、類組胺樣降血壓物質、異源蛋白、未知過敏反應物質及毒性雜質，且缺乏有效的理化分析方法加以判斷，影響藥物的療效及安全性。

過敏反應和急性毒性試驗均顯示舒洛地特有一定毒性，豚鼠的毒性癥狀主要表現為撓鼻、步態不穩等現象，小鼠的毒性癥狀主要表現為呼吸急促、步態不穩、跳躍、抽搐等，異常毒性設定限值時發現，采用LD50可信限下限的1／4進行供試品異常毒性檢查時，仍有小鼠死亡，臨床用藥有可能產生過敏及急性不良反應的風險。但由于其制劑在臨床使用的濃度遠低于產生毒性的濃度，設定的過敏反應和異常毒性的限值可保證其臨床用藥安全。目前，歐美等發達國家的醫藥企業正逐步取消異常毒性檢查項，但我國醫藥企業的生產工藝水平參差不齊，若原料質量及工藝控制出現問題，則均會導致雜質摻入[9-10]，毒性反應不能忽視，異常毒性檢查仍有必要設立，以控制毒性雜質含量[11]。建議生產廠家加強對產品的質量控制和改進生產工藝[12]。

通過建立舒洛地特原料藥過敏反應、降壓物質、異常毒性檢查法，可控制由于原料藥質量問題在臨床使用中引起的毒性反應、過敏反應和降壓反應等嚴重不良反應的發生，藥品安全性檢查法控制藥品質量的同時，還可結合臨床使用，但應注意監測凝血指標。舒洛地特服藥后可能會出現發熱反應，建議進一步對其熱原進行檢查，為臨床用藥的安全性提供保障。