反相高效液相色譜法同時測定中成藥保健食品中4種生育酚含量

張 競，王雪芹，王 倩，徐金玲，王海波

（河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450003）

維生素E又稱生育酚，為脂溶性維生素，具有抗氧化、抗衰老、促生育功能、提高免疫、保護肝臟、提高記憶、防治白內障、減輕腎損害等眾多生理功能[1]。按其來源可分為人工合成和天然維生素E，來自動植物的天然維生素E是苯并二氫呋喃的衍生物，共有8種類似物，包括 α，β，γ，δ-生育酚和 α，β，γ，δ-生育三烯酚，生理活性均不同，其中以 α-生育酚生理活性最強，其次為 β-生育酚[2]。測定維生素E的傳統方法主要有比色法、分光光度法、紅外光譜法、熒光分析法、電化學法、氣相色譜法等[3]，上述方法靈敏度和精密度均較低，準確性較差。高效液相色譜（HPLC）法的靈敏度、重復性、分辨率、分離效果均較好，本研究中參考文獻[4-11]，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對4種生育酚進行定量分析。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀，包括2998型光電二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；XPE205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XMTD-204型數顯式電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械有限公司）。

1.2 試藥

安睡美膠囊（洛陽新春都生物制藥有限公司，規格為每粒380 mg，樣品Ⅰ）；玉妍丸（漢南漢方藥業有限責任公司，規格為每粒0.14 g，樣品Ⅱ）；α-生育酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為190168-201601，含量為100.0%）、β-生育酚對照品（上海甄準生物科技有限公司，批號為 ZZS17121601，含量為96.0%）、γ-生育酚對照品（批號為 AC171010-12，含量為99.3%）、δ-生育酚對照品（批號為SM171007-28，含量為94.87%），均購自美國Stanford Analysis Chemicals公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC Carotenoid-C30柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～13 min 時96%A，13～20 min時 96%A→100%A，20～24 min時100%A，24～24.5 min時 100%A→96%A，24.5～30 min時 96%A）；流速：0.8 mL／min；檢測波長：294 nm；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品內容物適量，精密稱定，置150mL錐形瓶中，加20 mL溫水，混勻，再加1.0 g維生素C和0.1 g丁羥甲苯，混勻，加30 mL無水乙醇，15 mL氫氧化鉀溶液（50 g→100 g），搖勻后于80℃恒溫水浴振蕩皂化30 min，立即冷卻至室溫；將皂化液用30 mL水轉入250 mL分液漏斗中，加50 mL石油醚（30→60℃）-乙醚（1 ∶1，V／V）混合液，振蕩萃取 5 min，將下層溶液轉移至另一250 mL分液漏斗中，加入50 mL混合醚液再次萃取，合并醚層；用水洗滌至中性（約需3次，每次約30 mL）；將洗滌后的醚層經無水硫酸鈉濾入旋轉蒸發瓶中，用15 mL石油醚洗滌分液漏斗及無水硫酸鈉洗滌2次，洗液并入蒸發瓶內，于40℃下，水浴充氮氣蒸至近干；殘渣用甲醇溶解并轉移至10mL容量瓶中，定容，即得。

陰性對照品溶液：按樣品處方和工藝制備缺天然維生素E的陰性樣品，依法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：分別取2.2項下3種溶液各10μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖 1。結果理論板數按各待測成分峰計均大于9 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：精密量取混合對照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得質量濃度分別為 5，10，20，40，60 μg／mL的系列溶液。精密量取10 μL，按擬訂色譜條件進樣，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表 1。

表1 回歸方程與線性范圍（n=5）

精密度試驗：取混合對照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果 α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚峰面積的RSD分別為 1.12%，0.93%，0.60%，1.21%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液（樣品Ⅰ）適量，分別于室溫下放置 0，2，4，6，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果 α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚峰面積的RSD分別為1.80%，0.93%，1.31%，1.74%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：稱取同一批樣品（樣品Ⅰ）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定6次，記錄峰面積，并計算含量。結果 α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚平均含量分別為2.59，0.82，20.36，8.70 mg／g，RSD分別為 1.33% ，1.81% ，1.90%，1.64%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（樣品Ⅰ）適量，共6份，分別加入低、中、高質量濃度的對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表 2。

2.4 樣品含量測定

取各樣品適量，精密稱定，分別依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算含量。結果見表 3。

3 討論

3.1 分析方法和色譜柱選擇

表2 加樣回收試驗結果（n=6）

表3 樣品含量測定結果（mg／g，n=3）

3.2 流動相選擇

本試驗中考察了純甲醇和甲醇-水梯度洗脫2種流動相，純甲醇作流動相時，4種生育酚不能有效分離，β-生育酚和-生育酚色譜峰重疊；甲醇-水梯度洗脫時，則既能讓4種生育酚達到有效分離，又能防止其他脂溶性大分子雜質在色譜柱中的沉淀，延長了色譜柱的壽命。考察了 1.0，0.8，0.6 mL／min 3 種流速，流速越慢，各色譜峰分離效果越好，但樣品保留時間則相對延長，檢測靈敏度隨之降低。對比后選則了0.8 mL／min為流速，在保證足夠分離效果的前提下，使4種生育酚的保留時間控制在25 min以內，且峰寬適中。

3.3 不同樣品生育酚含量分析

本試驗中考察了2個不同廠家2個品種含天然維生素E的樣品，2個樣品中4種生育酚含量差異較大。維生素E中抗氧化作用最強的是 α-生育酚（活性為100%），然后是 β-生育酚（活性為 12% ～40%）、γ-生育酚（活性為3.0% ～20%）、δ-生育酚（活性為0.3% ～1.0%）。國際市場上，天然維生素E專門指活性最高的 α-生育酚，是從植物油加工副產物中提取純化而來。但市場上的天然維生素E質量參差不齊，尤其是α-生育酚含量差異較大。為有效控制含天然維生素E類中成藥和保健食品的質量，建議藥品和保健食品生產企業進一步考察處方中所添加天然維生素E的化合物類型及合理的添加劑量。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便，準確，精密度、穩定性、重復性、耐用性均較好，可用于同時測定中成藥保健品中4種生育酚含量。