豬用生物制品及相關(guān)豬源原輔材料中非洲豬瘟病毒核酸的檢測方法

1 適用范圍

1.1 豬用及采用豬源原輔材料制備的生物制品成品及半成品。

1.2 豬源毒種。

1.3 豬源細(xì)胞及相關(guān)制品生產(chǎn)用細(xì)胞。

1.4 其他豬源原輔材料，如組織、血清、胰酶衍生物等。

2 取樣和處理

2.1 疫苗

2.1.1 活疫苗 取至少2瓶樣品，按瓶簽注明頭份用適宜稀釋液分別稀釋成10頭份/0.2mL，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。

2.1.2 滅活疫苗 取至少2瓶樣品，等量混合后進(jìn)行以下處理：

2.1.2.1 油佐劑滅活疫苗 取36 mL混合疫苗，加入正戊醇4.0 mL，充分振蕩混合1 min，2～8℃冰箱靜置不少于60 min，直至油相和水相分離。取水相進(jìn)行核酸提取。

2.1.2.2 水性佐劑滅活疫苗

（1）鋁膠佐劑滅活疫苗 取混合疫苗5.0mL，搖勻，加入0.25 g解離劑CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），放入搖床（200 r/min）37℃解離1 h，5000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行核酸提取。

（2）其他水性佐劑滅活疫苗 直接取混合樣品進(jìn)行核酸提取。

2.2 其他生物制品和半成品凍干類制品，按活疫苗進(jìn)行取樣和處理；液體制品及半成品，取至少2份（瓶）樣品，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。

2.3 豬源毒種 取至少2支毒種。凍干毒種，按凍干前體積復(fù)溶后等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提??；非凍干毒種，等量混合后直接取混合液進(jìn)行核酸提取。

2.4 豬源細(xì)胞 除另有規(guī)定外，取至少2瓶細(xì)胞濃度不少于107.0個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液進(jìn)行核酸提取。

2.5 其他豬源原輔材料

2.5.1 豬組織 每種組織，分別取樣和處理。取不少于2.0g組織，研磨后用5倍體積滅菌PBS懸浮，70℃滅活30min，4℃下以2000～3000g離心10min，取上清液進(jìn)行核酸提取。

2.5.2 豬血清 每批血清取至少2個(gè)最小包裝的樣品，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。

2.5.3 豬胰酶 干粉狀胰酶，取至少2份樣品，根據(jù)使用情況分別配制成不低于2.5%濃度的溶液，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提??；液體胰酶，取至少2個(gè)最小包裝的樣品，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。

2.5.4 其他豬源衍生物 固體、液體或干粉狀豬源衍生物，可分別按組織、血清或干粉狀胰酶的方法進(jìn)行取樣和樣品處理。

3 核酸提取

3.1 試劑和器材

3.1.1 試劑 根據(jù)核酸提取方法確定，如氯仿、異丙醇、無水乙醇、0.1mol/L檸檬酸鈉（含10%乙醇）、75%乙醇等。

3.1.2 儀器 核酸含量測定儀；常溫臺(tái)式離心機(jī)；旋渦振蕩器；水浴鍋；微量移液器1套（最大量程分別為10、100、200、1000μL）。

3.1.3 耗材 1.5 mL帶蓋離心管，無菌吸頭（0～10、0～200、100～1000μL），一次性乳膠手套。

3.2 操作程序 采用Trizol法（也可以選擇其他等效核酸提取方法）提取樣品中的DNA。

3.2.1 取樣品250μL，加入750μL Trizol，顛倒混勻，室溫放置5min。

3.2.2 加入200 μL氯仿，充分混勻，室溫放置10min，4℃下以12000g離心15min。

3.2.3 棄去上清液，加入220 μL無水乙醇，顛倒混合，15～30℃放置2～3 min，2～8℃以2 000 g離心5min，沉淀物即為DNA。

3.2.4 棄去上清液，加入含10%乙醇的0.1 mol/L檸檬酸鈉750μL洗滌DNA，15～30℃放置30min，2～8℃以2000g離心5min。重復(fù)一次。

3.2.5 加入75%乙醇1.2 mL，重懸DNA沉淀，15～30℃放置20 min，4℃以2 000 g離心5 min?？芍貜?fù)一次，充分洗滌DNA沉淀。

3.2.6 棄去上清液，敞開離心管管口，在空氣中干燥5～10min，加入30～50μL無核酸酶滅菌水溶解DNA，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 注意事項(xiàng)

3.3.1 核酸提取試劑具有腐蝕和強(qiáng)變性能力，應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)，佩戴手套、口罩和護(hù)目鏡，防止液體飛濺到皮膚和眼睛。

3.3.2 后續(xù)的核酸檢測敏感性很高，要防止樣品之間相互污染，最好使用帶濾芯的槍頭，且每次吸取液體時(shí)均需更換槍頭。

3.3.3 為防止核苷酸降解，應(yīng)避免核酸酶污染，使用的耗材均需無核酸酶。

3.3.4 做好剩余樣品的無害化處理及操作臺(tái)面的消毒處理。剩余樣品可通過高壓滅菌或煮沸處理，也可放在1%衛(wèi)可或2%氫氧化鈉消毒液中浸泡處理，操作臺(tái)面使用1%衛(wèi)可擦拭。

3.3.5 提取后的DNA樣品要用錫箔紙封存，取樣時(shí)應(yīng)用槍頭直接刺破錫箔紙取樣，防止污染。

4 檢測

下列兩種方法可任選其一。

4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測法

4.1.1 試劑

4.1.1.1 熒光定量PCR試劑 本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit為例，也可選用其他熒光定量PCR試劑。

4.1.1.2 擴(kuò)增引物及探針 擴(kuò)增引物如下：

ASF-05-Zsak-1466F（10μmol/L）：5′-CCTCGG CGAGCGCTTTATCAC-3′；ASF-05-Zsak-1528R（10μmol/L）：5′-GGAAACTCATTCACCAAATCCT T-3′。

探針 ASF-05-Zsak-1486prob（10 μmol/L）：5′-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3′。

4.1.1.3 無核酸酶的滅菌水 PCR級(jí)別。

4.1.2 儀器 熒光定量PCR儀；微量移液器1套（最大量程分別為10、100、200、1000μL）。

4.1.3 耗材 1.5 mL帶蓋離心管，0.2 mL薄壁PCR管，熒光定量PCR 96孔板，0.1 mL熒光PCR八連管，無菌吸頭（0～10、0～200、100～1000μL），一次性乳膠手套。

4.1.4 操作程序

4.1.4.1 樣品DNA制備 按照前述方法進(jìn)行核酸提取。

4.1.4.2 反應(yīng)體系的配制 配制比樣品數(shù)量至少多4個(gè)的反應(yīng)體系，同時(shí)設(shè)置強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性對(duì)照。在強(qiáng)陽性和弱陽性對(duì)照反應(yīng)管中分別加入含有非洲豬瘟P72基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA各3μL，在陰性對(duì)照反應(yīng)管中加入3μL無核酸酶滅菌水。每個(gè)PCR反應(yīng)管中應(yīng)包含以下成分：

images/BZ_38_1321_2475_2225_2529.png2×ABI TaqMan Gene ExpressionMix ASF-05-Zsak-1466F（10 μmol/L）ASF-05-Zsak-1528R（10μmol/L）探針(10μmol/L)DNA無核酸酶滅菌水10 1 1 0.8 3 4.2總量20

4.1.4.3 反應(yīng)程序 將所有待檢樣品和強(qiáng)陽性、弱陽性、陰性對(duì)照反應(yīng)管放在熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：50℃ 2min，95℃ 5min，95℃ 15s，58℃退火延伸1min，45個(gè)循環(huán)（熒光信號(hào)收集在每次循環(huán)的退火延伸時(shí)進(jìn)行）。

4.1.4.4 結(jié)果判定

（1）閾值設(shè)定 試驗(yàn)操作結(jié)束后，確定Ct值。Ct值為每個(gè)樣品反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。

（2）質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)照組的檢測結(jié)果應(yīng)符合以下情況，此次檢測方為有效：陰性對(duì)照無Ct值，且無擴(kuò)增曲線；強(qiáng)陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)在18～22之間，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；弱陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)在33～35之間，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

（3）判定 陰性：無Ct值，且未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為樣品中無ASFV核酸；陽性：Ct值≤40，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判定為樣品中存在ASFV核酸；可疑：Ct值＞40，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判定為可疑，應(yīng)重檢。重檢后，Ct值≤40且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線者，判定為陽性，其他情況均判定為陰性。

4.2 普通PCR檢測法

4.2.1 試劑

4.2.1.1 PCR試劑 10×PCR緩沖液（含25mmol/L Mg2+），DNA擴(kuò)增酶，dNTP預(yù)混液。

4.2.1.2 擴(kuò)增引物 primer PPA-1（10 μmol/L）：5′-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3′（上游引物）；primer PPA-2（10 μmol/L）：5′-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3′（下游引物）。

4.2.1.3 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品 DL500。

4.2.1.4 TAE電泳緩沖液 配制方法見《電泳液標(biāo)準(zhǔn)配制流程》。

4.2.1.5 1%瓊脂糖凝膠板 在100mL 1×TAE緩沖液中加入1 g瓊脂糖，加熱融化，加入5.0 μL（10 mg/mL）溴化乙錠，混勻，倒入水平放置的凝膠盤中，膠板厚度達(dá)5.0mm左右。根據(jù)樣品數(shù)量選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣孔），放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。

4.2.2 儀器 DNA擴(kuò)增儀，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，水平電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)（或紫外透射儀），微量移液器1套。

4.2.3 耗材 1.5 mL帶蓋離心管，0.2 mL薄壁PCR管，無菌吸頭（0～10、0～200、100～1000 μL）。

4.2.4 操作程序

4.2.4.1 樣品DNA制備 按照前述方法進(jìn)行核酸提取。

4.2.4.2 反應(yīng)體系的配制 配制比樣品數(shù)量至少多3個(gè)的反應(yīng)體系，同時(shí)設(shè)立陽性和陰性對(duì)照。在陽性對(duì)照反應(yīng)管中加入非洲豬瘟P72基因重組質(zhì)粒2.0μL，在陰性對(duì)照反應(yīng)管中加入2.0μL無核酸酶滅菌水。每個(gè)PCR反應(yīng)管中應(yīng)包含以下成分：

images/BZ_39_1321_970_2225_1020.png10×PCR緩沖液DNA擴(kuò)增酶dNTP PPA-1（10 μmol/L）PPA-2（10 μmol/L）DNA無核酸酶滅菌水2 1 0.5 1 1 2 12.5總量20

4.2.4.3 反應(yīng)程序 將所有待檢樣品及陽性、陰性對(duì)照反應(yīng)管放在PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃ 2min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min，4℃保存。

4.2.4.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，加6×加樣緩沖液2.0 μL，混勻，用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)混合物進(jìn)行電泳分析，電壓120V，電流50mA，電泳時(shí)間30min。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，記錄檢測結(jié)果。

4.2.4.5 結(jié)果判定

（1）質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)照組的檢測結(jié)果應(yīng)符合以下情況，此次檢測方為有效：陰性對(duì)照不應(yīng)出現(xiàn)257 bp的特異性條帶；陽性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)257 bp的特異性條帶。

（2）判定 陽性：待檢樣品出現(xiàn)與陽性對(duì)照大小一致的擴(kuò)增條帶，判定為非洲豬瘟病毒核酸陽性，擴(kuò)增產(chǎn)物可通過DNA測序進(jìn)一步確定基因型；陰性：待檢樣品未出現(xiàn)與陽性對(duì)照大小一致的擴(kuò)增條帶，判定為非洲豬瘟病毒核酸陰性。

4.3 注意事項(xiàng)

4.3.1 檢測過程中應(yīng)遵循PCR實(shí)驗(yàn)分區(qū)原則，即應(yīng)區(qū)分試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)。

4.3.2 應(yīng)避免在含有靶序列的區(qū)域中使用引物，防止污染靶序列。

（本套檢測方法由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部權(quán)威發(fā)布）