刺梨果渣多糖的發酵制備工藝優化及其抗氧化活性研究

周笑犁，盧穎，朱坤瓏，王金華，杜斌，林棟

（貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州 貴陽 550005）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）屬于薔薇屬植物[1]，主要在西南地區有分布，其中貴州地區的刺梨產量尤為突出[2]。刺梨鮮果中有著豐富的維生素、多糖、有機酸、酚類、氨基酸和微量元素等營養成分[3-4]。多糖除具有調節免疫、抗腫瘤的生物學效應外，還有著降血糖、抗衰老等功效，而且對機體的副作用較小，因此多糖的開發成為了功能食品乃至新藥制品中極具發展潛力的方向[5-7]。刺梨作為貴州省藥食兩用資源被大力研究并開發的果品之一，其刺梨多糖是鮮果中主要的一種水溶性成分，楊江濤[6]報道了刺梨粗多糖具有提高衰老小鼠體內抗氧化的能力；陳代雄等[8]發現刺梨多糖可以增強動物的非特異性免疫和體液免疫應答；崔昊等[9]也發現刺梨多糖對補體途徑和替代途徑均有著積極的作用；而關于刺梨多糖的提取分離方面，分別用熱水浸提、微波法、超聲法、酶法4 種提取方法對所提取的刺梨多糖的理化性質進行比較[10-11]，對刺梨多糖的純化主要在分級沉淀、柱層析等[6]。由于多糖自身的結構較復雜、種類較多，其提取液中還含有寡糖、膠體等物質[12]。在本試驗中主要以刺梨加工副產物——果渣為試材，若采用耗時較長且工藝繁瑣的純化工藝必然會增加果品副產物再開發的成本，因此本研究在前期熱水浸提法對刺梨果渣多糖提取工藝的基礎上，加入安琪酵母菌進行發酵，菌種在生長和代謝的過程中會利用單糖、雙糖等小分子糖，還可將一些組分進行轉化并產生活性代謝產物，從而達到制備刺梨果渣多糖并提高其活性的目的[12-13]，該發酵法作為初步的純化耗能較低、操作簡易。通過探討液態發酵法制備刺梨果渣多糖的最佳工藝，可為刺梨果渣多糖的進一步開發應用提供理論基礎，為刺梨的綜合利用，尤其是果渣多糖等功效產品開辟新途徑。

隨著生活節奏的增加，環境的變化以及年齡的增長，機體在活動和代謝過程中會產生較多的氧自由基，但對于健康機體而言其維持著一定的平衡關系，當其平衡被打破后則有著較強的破壞性，對機體的生物膜系統造成損傷[14]，導致慢性疾病的發生。因此從天然資源中提取多糖等功效組分作為自由基清除劑，尤其從果蔬廢棄資源中提取活性成分，不僅能夠提高果蔬資源的綜合利用，還為食品添加劑的研制及進一步推廣應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨果渣：貴州省果品加工工程研究中心開發刺梨飲品加工后的副產物，經微波真空干燥至恒重，粉碎，制成刺梨果渣粉，備用。

安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；蒽酮、濃硫酸、葡萄糖、檸檬酸鈉、無水乙醇、DPPH、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵均為國產分析純。

LDZX-30KBS 高壓滅菌鍋：上海申安有限公司；TGL-16C 高速臺式離心機：北京市永光明醫療儀器廠；SPX-250B-Z 生化培養箱：上海博訊實業有限公司；UV-2550 紫外分光光度計：日本島津公司；SW-CJ-1G 超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺梨果渣多糖液及發酵原液的準備

通過前期研究熱水浸提法對果渣多糖的提取工藝[料液比 1∶20（g/mL），60 ℃恒溫水浴浸提 2 h]制備刺梨果渣多糖液。

發酵原液[13]：在100 mL 刺梨果渣多糖液中加入1 g葡萄糖、1 g 蛋白胨和0.5 g 酵母膏，115 ℃滅菌15 min后用于酵母發酵工藝的研究。

1.2.2 發酵菌種的制備

取安琪酵母菌進行培養，用血球計數板計數，其菌數含量為 106個/mL～107個/mL。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 接種量對果渣多糖含量的影響

分別加入1%、2%、3%、4%、5%酵母菌種液到刺梨果渣多糖原液中，30 ℃培養60 h，pH 5.0，考察接種量對發酵液中多糖含量的影響。

1.2.3.2 發酵時間對果渣多糖含量的影響

刺梨果渣多糖發酵原液中加入3%酵母菌種液，pH 5.0，于 30 ℃培養箱中分別培養 48、60、72、84、96 h，考察發酵時間對發酵液中多糖含量的影響。

1.2.3.3 pH 值對果渣多糖含量的影響

刺梨果渣多糖發酵原液中加入3%的酵母菌種液，于 30 ℃培養箱中培養 60 h，pH 值分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，考察初始pH 值對發酵液中多糖含量的影響。

1.2.3.4 發酵溫度對果渣多糖含量的影響

刺梨果渣多糖發酵原液中加入3 %的酵母菌種液，pH 5.0，分別在 25.0、27.5、30.0、32.5、35.0 ℃條件下培養60 h，考察溫度對發酵液中多糖含量的影響。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以發酵液中多糖含量為指標，L9（34）正交試驗進行優化，如表1所示。

表1 刺梨果渣多糖發酵法制備正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 驗證試驗

由正交試驗分析所確定的貴州產刺梨果渣多糖的酵母發酵法工藝參數進行驗證試驗。

1.2.6 多糖含量的測定

采用蒽酮-硫酸顯色法[15-16]測定，以吸光度值為縱坐標，葡萄糖標準液質量濃度為橫坐標，得到方程y=0.026 2x+0.000 2，相關系數R2=0.991 4。通過該線性方程計算發酵液中多糖的含量。

1.2.7 刺梨果渣多糖的制備

對酵母菌發酵制備的刺梨果渣多糖進行濃縮處理，然后加入無水乙醇進行醇沉過夜[17-18]，離心分離干燥后制得刺梨果渣多糖（即刺梨果渣多糖A）。

將刺梨果渣多糖A 中加入無水石油醚進行脫脂處理，重復3 次。然后采用Sevag 法脫蛋白[17-18]。最后得到的多糖液加入乙醇進行醇沉，重復3 次以除去Sevag 試劑，最后得到脫脂脫蛋白的刺梨果渣多糖（即刺梨果渣多糖B）。

1.2.8 抗氧化性分析

1.2.8.1 還原能力的測定

分別取不同濃度的果渣多糖樣品，依次加入0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液2.5 mL 和1 %六氰合鐵酸鉀溶液2.5 mL，50 ℃下反應20 min，快速冷卻再加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻，3 000 r/min 離心10 min，依次加入蒸餾水2.5 mL 和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL到上清液中，混合均勻后靜置10 min，測定700 nm 波長處的吸光值[19]。

1.2.8.2 DPPH 自由基的清除作用

用無水乙醇溶解1 mg DPPH 后定容至25 mL 用作母液，然后吸取DPPH 母液2 mL 定容至100 mL，分別吸取DPPH 溶液2 mL 和2 mL 乙醇或不同濃度的果渣多糖樣品，用力搖勻，避光反應30 min，以乙醇作為空白，在波長517 nm 處測定其吸光值；DPPH 溶液2 mL 和乙醇2 mL 的吸光度記為A0；多糖樣品液2 mL與DPPH 溶液2 mL 混合后以同樣的方法測定其吸光值記為Ai；乙醇2 mL+多糖樣品液吸光值2 mL 為Aj。清除率/%=[A0-（Ai-A）j]/A0×100[20-21]。

1.3 數據統計分析

試驗數據用平均值±標準差表示。用SPSS 軟件進行統計分析，以p＜0.05 作為差異顯著性的判斷標準。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 接種量對多糖含量的影響

接種量對多糖含量的影響見圖1。

圖1 接種量對多糖含量的影響Fig.1 Effects of inoculating volume on the polysaccharide yield

如圖1所示，隨著酵母菌接種量的增加多糖的含量呈逐漸上升的趨勢。接種量為1%時多糖含量顯著低于其他各組（p＜0.05）；當接種量為3%時多糖的含量最高（p＜0.05）；接種量大于3%時，其含量則呈下降趨勢（p＞0.05）。這可能是由于酵母菌接種量較低時菌種和原料接觸不充分，而接種量過大則導致在有限的營養物質下酵母菌生長受到限制，從而致使后續發酵制備動力的不足，也可能由于菌種的不斷增殖產生了次級代謝產物，而產物的不斷積累缺抑制了試驗菌種的正常生長[12-13]，故選擇3%、4%和5%的接種量作為正交試驗的3 個水平。

2.1.2 發酵時間對多糖含量的影響

發酵時間對多糖含量的影響見圖2。

圖2 發酵時間對制備多糖含量的影響Fig.2 Effects of fermentation time on the polysaccharide yield

發酵時間的逐漸延長，發酵液中多糖的含量逐漸降低后有回升的趨勢，但各組間多糖的含量均差異不顯著（p＞0.05）。說明酵母菌在生長的過程中主要以單糖和雙糖為優勢碳源，而對三糖的利用則因酵母菌的種類不同而存在著一定的差異[12]，本試驗中可能由于刺梨果渣多糖發酵液中酵母菌在48 h 已趨于穩定，因此后續發酵相對平緩，致使多糖含量的變化沒有顯著性差異（p＞0.05）。選擇多糖含量值最高的3 組即48、84 h 和96 h 的發酵時間作為下一步正交試驗的3 個水平。

2.1.3 初始pH 值對多糖含量的影響

pH 值對多糖含量的影響見圖3。

隨著pH 值的增加，酵母發酵制備多糖的含量逐漸增加（p＜0.05），直到 pH 值大于 6.0 時多糖的含量顯著低于其他各組（p＜0.05），這可能是因為酵母菌適宜在偏酸性環境生長的原因，在pH 值為中性時的發酵原液則影響了酵母菌細胞質膜電荷及其穩定性和菌體的代謝酶活性，從而改變了酵母菌對發酵液中營養物質的吸收利用情況。在pH 值為5.0 時，酵母菌的生長情況最佳，其多糖含量顯著高于其他各組（p＜0.05）。

圖3 pH 值對多糖含量的影響Fig.3 Effects of pH value on the polysaccharide yield

2.1.4 發酵溫度對多糖含量的影響

發酵溫度對多糖含量的影響見圖4。

圖4 發酵溫度對多糖含量的影響Fig.4 Effects of fermentation temperature on the polysaccharide yield

由于酵母菌屬于真核微生物，故取25 ℃～35 ℃作為制備工藝的溫度優化范圍。如圖4所示，該溫度區間較適合進行酵母菌發酵多糖，多糖含量在30 ℃時達到最大（p＜0.05），說明更利于酵母利用小分子的糖類。溫度在25 ℃～30 ℃時，發酵制備液中多糖的含量隨溫度的升高而逐漸增加，可能是緣于該溫度范圍不能達到酵母菌的最適生長溫度，從而使得酵母菌利用單糖的能力較低；當溫度30 ℃～35 ℃時，發酵制備液中多糖的含量卻緩慢降低，可能是該溫度不利于酵母菌自身的生長，從而導致代謝活性不高。

2.2 正交試驗

通過對酵母菌發酵法制備貴州產刺梨果渣多糖的酵母菌種添加量、發酵液起始pH 值、發酵時間和發酵溫度4 個因素進行單因素分析后，對較優的3 個水平進行正交試驗，見表1。試驗結果及直觀分析見表2，對貴州產刺梨果渣多糖的酵母發酵法制備主次順序A＞D＞C＞B，即菌種接種量＞pH 值＞發酵時間＞發酵溫度；并得出酵母發酵制備果渣多糖的最適工藝條件為A1B3C2D1，即酵母菌液的添加量為3%，發酵溫度為32.5 ℃，發酵時間為 84 h，發酵起始 pH 為 4。

表2 正交試驗結果分析表Table 2 The orthogonal experiment results analysis table

2.3 驗證試驗

本試驗利用酵母菌生長過程中會利用多糖原液中的單糖、雙糖等[12]，使得果渣多糖的純度提高，這為后期刺梨果渣廢棄物開發工藝奠定了基礎。通過正交試驗確定酵母菌發酵法制備果渣多糖的最優工藝條件進行驗證試驗，由3%酵母菌液添加到刺梨果渣多糖發酵原液中，pH 值為4，在32.5 ℃的培養箱進行發酵純化84 h，得到刺梨果渣多糖的含量為（3.19±0.1）mg/mL，均高于正交試驗中各組的多糖含量。

2.4 酵母發酵純化刺梨果渣多糖的抗氧化活性

2.4.1 還原能力

刺梨果渣多糖的還原能力見圖5。

圖5 刺梨果渣多糖的還原能力Fig.5 The reducing power of polysaccharides extracted from Rosa roxburghii Tratt residue

不同濃度的各組刺梨果渣多糖均具有還原能力，并且有著一定的劑量依賴關系，隨著濃度的增加，還原能力逐漸增大（p＜0.05）。經過發酵制備的刺梨果渣多糖將Fe3+還原為Fe2+的能力優于多糖原液，尤其在0.5、1.0 mg/mL 時顯著增加（p＜0.05）；而與唐健波等[10]報道的微波、超聲法提取刺梨多糖的還原能力相比，0.1、0.5 mg/mL 發酵制備多糖較優，但低于張匯慧[22]報道的刺梨黃酮的還原能力，并且，對發酵制備多糖進行脫脂脫蛋白處理后（刺梨果渣多糖B）的還原能力均顯著高于其他各組（p＜0.05）；說明經過酵母菌制備的多糖具有良好的還原能力。

2.4.2 對DPPH 自由基清除能力

刺梨果渣多糖對DPPH 自由基的清除能力見圖6。

圖6 刺梨果渣多糖對DPPH 自由基的清除能力Fig.6 The DPPH radical scavenging effect of polysaccharides extracted from Rosa roxburghii Tratt residue

本試驗中多糖原液、發酵制備多糖（A）及其脫脂脫蛋白后的多糖（B）對DPPH 自由基的清除能力分別為60 %、70 %和80 %左右，且發酵前后差異顯著（p＜0.05），說明多糖對自由基的清除能力與其純度有關，純度越大清除能力越強；或者利用微生物對多糖原液進行發酵的過程中產生了一些次級代謝產物，而這些代謝產物也有一定的抗氧化能力[13]，本試驗的結果與鐵皮石斛發酵制備所得多糖的抗氧化活性更強相似[13]。發酵制備多糖對DPPH 自由基清除能力優于5 mg/mL 薏苡仁多糖液[23]，低于 1 mg/mL 紫甘薯花色苷[24]、0.08 mg/mL 藍莓酒渣花色苷[25]及刺梨黃酮[22]對DPPH 自由基的清除率，說明刺梨果渣多糖的抗氧化作用弱于花色苷等活性物質。另外，隨著多糖原液和發酵液濃度的增加，其自由基清除率增大，但差異不顯著（p＞0.05），經過脫脂脫蛋白發酵多糖的清除率達到最大（p＜0.05），可能由于多糖原液樣品中所含的蛋白質或脂類阻礙了對自由基的清除效果。

3 結論

本試驗在單因素試驗（接種量、起始pH 值、發酵時間和溫度）的基礎上，通過L9（34）正交試驗選出采用安琪酵母菌發酵法制備貴州產刺梨果渣多糖的工藝條件，即為菌種的接種量3%、初始pH 值為4、發酵溫度32.5 ℃的條件下培養84 h。在試驗濃度范圍內，對還原能力和DPPH 自由基的清除率隨著貴州產的刺梨果渣多糖濃度的增大而逐漸升高，并且發酵法制備的多糖其抗氧化能力強于多糖原液，說明經過發酵可以提高體外抗氧化活性，從而為果渣多糖的進一步推廣應用提供了依據。因此刺梨果渣發酵制備多糖作為天然抗氧化劑或膳食添加劑的開發使用，不僅緩解了資源的浪費和環境的污染，而且制備工藝簡單、成本低廉，對于刺梨果渣等果蔬加工副產物的綜合開發及新型食品的研制有著一定的應用價值。