Ca（OH）2對銀杏葉茶中銀杏葉酚酸的影響研究

范維江，唐佳佳，汪洋，賈旭妹

（山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，山東 濟南 250103）

銀杏葉茶是采用一定的工藝將銀杏葉制成的保健茶[1-2]。1994 年我國銀杏葉茶開始興起，兩湖、江浙、山東等省份均生產(chǎn)銀杏葉茶[3]。據(jù)不完全統(tǒng)計，全國范圍內(nèi)的銀杏葉茶加工廠大約有100 余家，其中山東省20 余家，所占比例最高，年產(chǎn)量最多的廠家不超過5 000 kg，最少的廠家僅500 kg[3]。銀杏葉茶廠雖不少，但因為不注重銀杏葉的特殊性，使得所制出來的茶葉外形不好看，香氣極淡，茶湯無色，滋味苦澀，有效成分損失嚴(yán)重，因此所制的茶葉適口性特別差。

銀杏葉中含有的水溶性化學(xué)成分大部分都對人體有較顯著的保健作用[4]，如果能時常飲用，能有效抗衰老和抗氧化，并且在治療和預(yù)防心腦血管疾病方面有一定的效果，譚志鑫的研究說明銀杏葉茶具有保護缺血-再灌注損傷時心肌的收縮和舒張功能，從而有效地保護了心臟的舒縮活動[5]。許秀舉等[6]通過測定實驗小鼠胃組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），說明銀杏茶對于酒精所引起的超氧化物歧化酶的損傷具有非常明顯的保護作用。

銀杏茶中的銀杏酚酸具有致敏性、致細(xì)胞毒性成分，讓廣大消費者望而卻步[7]。未經(jīng)處理的銀杏葉中含有較高的銀杏酚酸[8]，銀杏酚酸具有獨特的藥理活性日益受到人們的廣泛關(guān)注[9]。但是銀杏酚酸對人體有毒副作用，會產(chǎn)生肌肉抽搐、瞳孔放大等癥狀[10]。有研究報道[11-13]，以利用超臨界CO2不僅可以選擇性地萃取出銀杏葉中的銀杏酚酸，而且對其中的有效成分黃酮和內(nèi)酯無影響，保持了銀杏葉茶良好的口感。廖賢軍等冷凍后發(fā)酵可降低銀杏葉中銀杏酚酸的含量，改善銀杏葉茶的口感和風(fēng)味[7]。

本研究以銀杏葉為研究對象，參照綠茶的加工工藝制備銀杏葉茶，制作過程中添加不同劑量的Ca（OH）2，以水浸出物含量、游離氨基酸含量、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、黃酮類化合物含量等主要功能成分以及感官評價作為評價指標(biāo)，研究Ca（OH）2的投入量對銀杏葉茶中銀杏葉酚酸的影響情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗原料

銀杏葉，葉長約為5 cm～9 cm，淡黃色，無蟲壞，采摘于山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園。

1.1.2 主要試劑

甲醇：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化亞錫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（均為分析純）：天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；茚三酮、氫氧化鈣、95%乙醇（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；植物型POD試劑盒：南京建成生物工程研究所；銀杏酸C15∶1：中國藥品生物制品鑒檢定所。

1.1.3 主要儀器

UV754N 紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHK-III 循環(huán)水式多用真空泵：鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司；ME204E/02 型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW 電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BGZ-30 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；UPLC I-Class 高效液相色譜儀：美國waters 公司。

1.2 試驗方法

工藝流程：原料處理→萎凋→漂燙殺青→揉捻→干燥→分揀包裝。

1.2.1 樣品的制備

處理鮮葉時，應(yīng)先將病蟲葉、雜質(zhì)等剔除，然后剪去葉柄。銀杏葉清洗2 次～3 次，瀝干水分，均勻攤在桌上晾曬，使葉子完全枯萎，再進行殺青、揉捻。

取萎凋處理好的銀杏葉50 g，分別添加0.32、0.4、0.48 g 的 Ca（OH）2，在設(shè)置溫度為 90 ℃的水浴鍋里殺青4 min，取出后清洗3 次以除去葉面上的Ca（OH）2殘留。然后攤涼，揉捻，干燥。攤晾入袋后分別貼上標(biāo)簽 D1，D2，D3。

1.2.2 銀杏葉茶的感官評價

取成茶3 g，分別用150 mL 的沸水沖泡5 min，將編號遮擋，請10 位同學(xué)品評后，對茶的外形、湯色、香氣、滋味進行打分，每項滿分為10 分，然后使用加權(quán)法計算總分（總分=外形×0.1+湯色×0.3+香氣×0.3+滋味×0.3），最后取平均值。銀杏葉茶成茶感官評定細(xì)則見表1。

表1 銀杏葉茶成茶感官評定細(xì)則Table 1 Rules for sensory evaluation of ginkgo leaf tea

1.2.3 水浸出物含量的測定

將瓷坩堝連同15 cm 的定性快速濾紙置于（120±2）℃的恒溫干燥箱中烘干1 h，干燥器中冷卻至25 ℃，直至恒重（前后兩次稱重之差小于0.2 mg）。稱量2.000 g 磨碎試樣，加沸蒸餾水300 mL，沸水浴中浸提45 min（每10 min 搖動一次），浸提完畢后趁熱減壓過濾，用約150 mL 的沸蒸餾水洗滌茶渣數(shù)次。茶渣和濾紙移入坩堝置于120 ℃烘干1 h。取出后，冷卻1 h 后再烘干，冷卻至室溫后稱重，直至恒重后，可求得水浸出物含量[14]。

式中：m1為干燥后茶渣質(zhì)量，g；m0為試樣質(zhì)量，g；w 為試樣干物質(zhì)含量，%。

1.2.4 游離氨基酸含量的測定

稱取2 g 茚三酮、80 mg 氯化亞錫溶于50 mL 蒸餾水中，分次加少量水溶解，于暗處靜置24 h，過濾后定容至100 mL 待用。在比色管中加入0.5 mL，pH8.0 的磷酸緩沖液，0.5 mL 茚三酮和1 mL 試樣，沸水浴5 min，冷卻后定容至25 mL，放置10 min 后，用3 mm 的玻璃比色皿于570 nm 處測定吸光度，用試樣空白溶液作為參比[15]。

式中：C 為所測得的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的谷氨酸的毫克數(shù)，mg；V1為試液總量，mL；V2表示測定用試液量，mL；m 為試樣用量，g；w 為試樣干物質(zhì)含量，g。

1.2.5 POD 酶活性的測定

采用過氧化物酶（POD）試劑盒測定銀杏葉茶中的POD 酶活性。其測定原理是利用過氧化物酶（POD）催化過氧化氫反應(yīng)的原理，通過測定420 nm 處吸光度的變化得出其活性。

稱取銀杏葉茶1.0 g 放入研缽中，加入勻漿介質(zhì)9 mL（0.1 mol/L pH 7.0～7.4 的磷酸鹽緩沖液），冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿液，然后轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中，使用離心機3 500 r/min 離心10 min，取上清液。具體操作見表2。

表2 POD 酶活性測定操作表Table 2 Operation table for determination of POD enzyme activity

混勻后，再使用離心機3 500 r/min 離心10 min，取上清液于波長420 nm 處，1 cm 光徑，調(diào)零后測定各吸光度。

1.2.6 黃酮類化合物和銀杏葉酚酸的測定

取10 mg 銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品用色譜純甲醇溶解定容至100 mL，得濃度為 100 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液[16]。

稱取5.0 g 樣品，粉碎后溶于50%的乙醇，然后在80 ℃條件下水浴5 h，水浴過程中需要不停攪拌[17]。將水浴后的樣液抽濾后濾渣用50%的乙醇再提取1 h，重復(fù)兩次。將3 次抽濾所得的提取液混合后旋轉(zhuǎn)蒸干至3 mL～5 mL，真空冷凍干燥機凍干，備用。取0.2g 凍干樣品，加入 10 mL 甲醇，渦旋 1 min，超聲 5 min 后，取100 μL 加入 900 μL 甲醇水稀釋，用 0.22 μm 濾膜過濾，取0.5 mL 濾液加入0.5 mL 1%甲醇水[18]。使用高效液相色譜儀測定銀杏葉茶中銀杏酸和蘆丁含量[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Ca（OH）2投入量對銀杏葉茶的感官影響

不同Ca（OH）2投入量時銀杏葉茶的感官評價結(jié)果見表3。

表3 不同Ca（OH）2 投入量時銀杏葉茶的感官評價結(jié)果Table 3 Sensory evaluation of different addition of Ca（OH）2 in Ginkgo biloba leaf tea

由表3可知，漂燙殺青時Ca（OH）2投入量不同對銀杏葉茶的顏色、質(zhì)地、氣味均有影響。當(dāng)Ca（OH）2的投入量為0.32 g 時，成茶的質(zhì)地、氣味效果較差，而當(dāng)Ca（OH）2投入量為 0.4 g 時，成茶的顏色、質(zhì)地、氣味均是最佳，銀杏葉成茶的感官評價分值最高。

2.2 對水浸出物含量的影響

浸出物含量的高低反映了茶葉中可溶性物質(zhì)的多少，標(biāo)志著茶湯的厚薄、滋味的濃強程度，從而在一定程度上還反映茶葉品質(zhì)的優(yōu)劣。不同Ca（OH）2投入量對銀杏葉茶水浸出物含量的影響如圖1所示。

圖1 Ca（OH）2 投入量變化對水浸出物含量的影響Fig.1 Effect of different levels of Ca（OH）2 for the content of water extract

當(dāng)Ca（OH）2的投入量增加時，銀杏葉茶的水浸出物含量也相應(yīng)增加，說明Ca（OH）2投入量增加引起水浸出物含量的增加，并呈一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。當(dāng)Ca（OH）2投入量為0.48 g 時，水浸出物含量值最高。

2.3 對游離氨基酸含量的影響

茶葉中氨基酸的組成、含量以及組分間的含量變化直接影響到茶葉的香氣和滋味，對銀杏葉成茶的品質(zhì)具有重要作用。不同Ca（OH）2投入量對銀杏葉茶游離氨基酸的影響如圖2所示。

圖2 Ca（OH）2 投入量變化對銀杏葉茶游離氨基酸的影響Fig.2 Effect of different levels of Ca（OH）2 for free amino acids in ginkgo leaf tea

Ca（OH）2投入量與銀杏葉成茶的游離氨基酸含量成反向關(guān)系，并呈一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。加入的Ca（OH）2質(zhì)量增加時，銀杏葉茶游離氨基酸含量就相應(yīng)降低。當(dāng)加入的 Ca（OH）2含量為 0.4 g 及 0.48 g 時，二者游離氨基酸含量差別不大。

2.4 對POD酶活性的影響

制茶工藝的高溫破壞鮮葉中過氧化物酶的活性，抑制多酚類物質(zhì)的氧化，直接影響風(fēng)味的形成。不同Ca（OH）2投入量對銀杏葉茶POD 酶活性的影響如圖3所示。

圖3 Ca（OH）2 投入量變化對銀杏葉茶POD 酶活性的影響Fig.3 Effect of different addition amounts of Ca（OH）2 for POD activity in ginkgo leaf tea

當(dāng)Ca（OH）2的投入量為0.32 g 時，銀杏葉茶的POD 酶活性最高，即銀杏葉茶POD 酶的活性較另兩種條件而言，沒有被明顯抑制，對銀杏葉茶的香氣滋味有不利的影響。試驗結(jié)果表明，Ca（OH）2投入量的增加可以降低銀杏葉茶的POD 酶活性。

2.5 對黃酮類化合物的影響

圖4為銀杏酸及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析結(jié)果。

D1的色譜分析圖見圖5。

圖4 銀杏酸及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析圖Fig.4 Chromatographic assayof ginkgolic acid and rutin trihydrate standard

圖5 D1 的色譜分析圖Fig.5 D1 Chromatographic analysis

制茶過程中，添加 0.32 g Ca（OH）2時，蘆丁含量為0.003 mg/mL，銀杏酸未檢出。

D2的色譜分析圖見圖6。

當(dāng) Ca（OH）2的投入量為 0.40 g 時，蘆丁含量為0.001 mg/mL，銀杏酸含量為0.002 mg/mL。

D3的色譜分析見圖7。

圖6 D2 的色譜分析圖Fig.6 D2 Chromatographic analysis

圖7 D3 的色譜分析圖Fig.7 D3 Chromatographic analysis

當(dāng) Ca（OH）2的投入量為 0.40 g 時，蘆丁含量小于0.001 mg/mL，銀杏酚酸未檢出。

綜上試驗結(jié)果表明，在制茶過程中加入Ca（OH）2后，銀杏葉茶的蘆丁含量結(jié)果相差不大，其含量范圍在 0.001 mg/mL～0.006 mg/mL 之間。而加入 Ca（OH）2后，銀杏葉茶中銀杏酸含量均≤0.006 mg/mL，小于規(guī)定限量，可能是銀杏葉酚酸與Ca（OH）2生成了對人體有益的銀杏葉酚酸鈣。

3 結(jié)論

本研究在制作銀杏葉茶過程中，加入Ca（OH）2對銀杏葉茶的滋味、香氣、湯色、外形均有影響，加入Ca（OH）2所制得的成茶感官評價的分值比未加Ca（OH）2的分值高，當(dāng)加入的Ca（OH）2含量為0.4 g 時，銀杏葉成茶的感官評價分值最高；但是加入Ca（OH）2對銀杏葉茶的蘆丁含量影響不大，其含量范圍在0.001～0.006 之間；與此同時，加入Ca（OH）2的銀杏葉茶中銀杏葉酚酸均為未檢出，我們推測銀杏葉酚酸與Ca（OH）2發(fā)生反應(yīng)生成了對人體有益的銀杏葉酚酸鈣，這也是加入Ca（OH）2所制得成茶感官評價較高的原因之一，這一結(jié)果有待進一步研究驗證。