藕皮多酚提取工藝優化及其體外抗氧化性研究

姚宏亮，沈潔，佴逸凡

（金陵科技學院食品科學系，江蘇 南京 210038）

蓮藕是我國種植面積最大且產量最高的水生蔬菜品種[1]，主要種植于湖北、江蘇、山東、安徽、福建、湖南、浙江等地區[2]。蓮藕除用于菜肴類原料加工之外，其工業化生產主要有速食藕片、藕粉、藕汁等。蓮藕營養豐富，其在多種常見蔬菜中體現出了相對較強的抗氧化能力[3]，這與其含有豐富的植物多酚類物質密切相關。植物多酚廣泛存在于植物各個部位，具有抗氧化[4]，免疫及抗炎癥[5]，預防阿爾茨海默病及帕金森綜合征[6]，抗癌作用[7]，抑菌[8]等多種生物活性功能。近年來，天然產物中植物多酚的生理活性受到國內外研究者的廣泛關注。植物多酚類物質在蓮藕的不同部位含量不同，藕節最高，其次是藕皮，再者是藕可食部分[9]。蓮藕的加工形式主要有水煮藕片、冷凍藕夾、藕粉、蓮藕汁等，在這些產品的加工過程中，產生大量的藕皮廢棄物，不但造成環境污染還浪費資源。因此，開展蓮藕廢棄物中多酚類物質的提取及抗氧化特性研究十分必要，不僅可以變廢為寶，提高經濟價值，并且可以減少環境污染，具有良好的社會效益和經濟效益。

植物多酚的提取有溶劑萃取法、超聲波提取法、微波提取法等[10]，其中溶劑萃取法最為經典、應用最為廣泛。關于蓮藕中多酚的提取研究國內已有不少報道，如周瑋婧等對蓮藕藕節中的多酚進行了提取[11]并對多酚提取物進行了體外抗氧化活性[12]研究。覃海明[13]對蓮藕中多酚的提取及抗氧化活性進行了評價。關于藕皮中植物多酚的提取研究還較少，劉煥云[14]對藕皮中的多酚類物質進行了提取并對其抗油脂氧化的能力進行了分析，藕皮中多酚提取物清除自由基能力的研究分析尚未見報道。本文采用乙醇萃取法對廢棄藕皮中的植物多酚進行提取，并分析多酚提取物清除自由基的能力，旨在為廢棄藕皮的增值利用提供理論基礎和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓮藕皮：揚州華貴食品有限公司。

硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、焦性沒食子酸、無水乙醇、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA二鈉）、抗壞血酸、雙氧水：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；番紅花紅T、1，1-二苯基-2-苦基肼（1-1-diphenyl 2-picryl hydrazyl ，DPPH）：生物試劑，上海源葉生物有限公司。

酒石酸亞鐵溶液配制：取硫酸亞鐵1.0 g 以及酒石酸鉀鈉5.0 g，定容至1 L；磷酸鹽緩沖溶液配制：將0.066 7 mol/L 的磷酸氫二鈉溶液以及0.066 7 mol/L 的磷酸二氫鉀溶液以84∶16 的比例混合再調節pH 值至7.5。

HH-2 數顯恒溫水浴鍋、85-1 型恒溫磁力攪拌器：常州潤華電器有限公司；FA 1204B 型/YP1002N 型電子天平：上海精密天美科學儀器有限公司；Alpha-1860型紫外可見光分光光度計：上海譜元儀器有限公司；KQ-800KDV 型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；OHG-907385-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；RHP-400 型高速多功能粉碎機：永康市榮浩工貿有限公司；DDL-5M 低速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的預處理

將藕皮用清水洗凈后置于60 ℃恒溫干燥箱中連續干燥6 h，然后用多功能高速粉碎機粉碎，并用100目篩網進行過篩，備用。

1.2.2 多酚含量的測定及標準工作曲線的建立

參考文獻[15]，采用酒石酸亞鐵法測定多酚含量，以焦性沒食子酸溶液作為標準品繪制標準曲線。將獲得的藕皮多酚提取物按同樣的方法測定吸光度，計算多酚含量。

配制濃度為0.25 mg/mL 的標準焦性沒食子酸溶液，然后用微量移液器分別吸取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于一系列刻度試管中，用超純水將溶液體積補至為1.0 mL，再加入酒石酸亞鐵溶液1.0 mL，然后加入pH7.5 的磷酸鹽緩沖溶液3.0 mL，混勻，靜置15 min，隨后在540 nm 處測定吸光度值，以焦性沒食子酸標準溶液的濃度為橫坐標，以其吸光度值為縱坐標，繪制成標準工作曲線。

1.2.3 藕皮中多酚的提取

精確稱取0.5 g 藕皮粉于離心管中，加入一定量一定濃度的乙醇溶液，置于一定溫度的水浴鍋中水浴提取一段時間。提取完成后進行離心（3 780 g，4 ℃，10 min），取上清液定容至25.0 mL。準確吸取1.0 mL 樣液于刻度試管中，加酒石酸亞鐵溶液1.0 mL，加磷酸鹽緩沖溶液3.0 mL，混勻，靜置15 min，隨后在540 nm 處測定其吸光值。同時用1.0 mL 超純水代替1.0 mL 樣液作空白對照試驗。測定出吸光值后，通過焦性沒食子酸標準工作曲線計算得出蓮藕皮中多酚物質的濃度c，再利用下列公式計算多酚提取得率。計算公式：

式中：w 為蓮藕皮中多酚類物質提取得率，mg/g；c為提取液中多酚的質量濃度，mg/mL；V 為提取液的體積，mL；m 為蓮藕皮粉的質量，g。

1.2.4 藕皮中多酚提取工藝優化

1.2.4.1 單因素試驗

采用1.2.3 方法提取得到藕皮多酚。提取條件為：固定料液比 1∶20（g/mL），提取溫度 80 ℃，提取時間3 h，考察不同乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%）對提取得率的影響；固定料液比1∶20（g/mL），提取溫度80 ℃，乙醇濃度為50 %，考察不同提取時間（2、3、4、5、6、12、24 h）對提取得率的影響；固定料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度為 50%，提取時間為 3 h，考察不同提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）對提取得率的影響；固定乙醇濃度為50%，提取時間為3 h，提取溫度為 80 ℃，考察不同料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g/mL）]對提取得率的影響。

1.2.4.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，每個因素選取3 個水平，建立四因素三水平L9（34）正交試驗。通過正交試驗對提取工藝進行優化。

1.2.5 藕皮多酚體外抗氧化能力的測定

1.2.5.1 羥基自由基消除率測定

采用Fenton 體系OH·清除法，參考文獻[16]并做適當改動：取0.2 mol/L pH7.4 磷酸鹽緩沖溶液1mL、0.52 mg/mL 番紅溶液 0.2 mL，0.2 mol/L EDTA 二鈉溶液 0.5 mL，0.2 mol/L FeSO4溶液 0.5 mL，不同濃度的樣品溶液（抗壞血酸或藕皮多酚提取物）7 mL，超純水0.8 mL，混勻，然后在 40 ℃水浴加熱 30 min，測定520 nm 處吸光值，記為A參比；用0.3%雙氧水溶液代替上述操作中的超純水，重復操作，測定520 nm 處吸光值，記為A樣液，用超純水代替A樣液操作中的樣品溶液，測定520 nm 處吸光值，記為A羥基，用超純水代替A參比操作中的番紅溶液及樣品溶液，測定520 nm 處吸光值，記為 A空白。

1.2.5.2 DPPH 自由基消除率的研究

參考文獻[17]并作適當改動：取1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液及3 mL 無水乙醇；取1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液及3 mL 樣品溶液（抗壞血酸或藕皮多酚提取物）；取1 mL 無水乙醇溶液及3 mL 樣品溶液（抗壞血酸或藕皮多酚提取物）在暗處靜置30 min，用分光光度計在517 nm 處測其吸光值，分別記為A0、AX、AX0。用4 mL 無水乙醇作為空白對照。

1.2.5.3 超氧陰離子自由基（O2-·）自由基消除率的測定

采用鄰苯三酚自氧化法，參考文獻[18]并做適當改動：取 4 根試管，分別標注為 1、2、3、4 號。在 1、2 號管里分別加入超純水1 mL，50 mmol/L pH 8.2 Tris-HCL緩沖液3 mL，在3 號管里加入100 mmol/L HCl 1 mL，在4 號管里加入5 mmol/L 鄰苯三酚1 mL。將這4 管放入25 ℃水浴鍋里保溫10 min，然后將3 號管中物倒入1號管里，4 號管中物倒入2 號管里，迅速混勻，在325nm 處測5min 內吸光值A0的變化。根據吸光值A0作圖得到鄰苯三酚自氧化速率K0。按照上述步驟將1、2 號管里的超純水替換成不同濃度的樣品溶液（抗壞血酸或藕皮多酚提取物）。放入25 ℃水浴鍋里保溫10 min 后迅速混勻。測5 min 內吸光值A1的變化。根據吸光值A1作圖得到分光光度值變化速率K1。

1.2.6 數據分析

試驗重復3 次，數據結果以平均值±標準偏差的形式表示。數據分析采用EXCEL，IBM SPSS Statistics 22 軟件，制圖采用Adobe Illustrator 軟件。

2 結果與分析

2.1 標準工作曲線

焦性沒食子酸標準溶液在濃度范圍0.01 mg/mL～0.05 mg/mL 內，吸光值（Y）與濃度（X）呈良好的線性關系，線性方程為 Y=18.083X-0.008（R2=0.999 2）。標準工作曲線如圖1所示。

圖1 焦性沒食子酸標準曲線Fig.1 The standard curve of pyrogallic acid

2.2 藕皮中多酚提取工藝優化

2.2.1 單因素試驗結果

單因素試驗結果見圖2。

由圖2-A 可以看出：隨著乙醇濃度不斷上升，多酚提取得率也在逐步增大，當乙醇濃度達到50%時，多酚提取得率達到最大值，而如果再繼續增大乙醇濃度多酚提取得率反而下降。由圖2-B 可以看出：當提取時間增加，多酚提取得率也在逐步增大，當提取時間達到3 h 時，多酚提取得率達到最大值，如果再繼續增大提取時間則多酚提取得率反而下降，將提取時間延長至12、24 h，多酚提取得率依舊呈現略微趨勢。由圖2-C 可以看出：隨著提取溫度不斷上升，多酚提取得率也逐步增大，且當提取溫度為80 ℃時，多酚提取得率達到最大值，且70、80、90 ℃時的提取得率差異不顯著。考慮到溫度高對反應條件不友好，且有可能對多酚物質造成破壞，因此提取溫度宜選擇80 ℃左右。隨著乙醇濃度、提取時間、提取溫度的增加，多酚提取得率均呈現先提高后下降或趨于平衡的結果。這應該與植物原料中纖維素在上述因素的作用受到破壞促進多酚物質提取，而隨后而當乙醇濃度過大時，加熱時間過長，提取溫度過高則可能會破壞多酚類物質，導致多酚提取得率的降低[19]。由圖2-D 可以看出：隨著提取液比例不斷增加，多酚提取得率也逐步增大，且當料液比達到1∶25（g/mL）時，多酚提取得率達到最大值，此時如果再繼續提高料液比多酚提取得率趨于平緩。這應該是物料中所能提取的多酚類物質幾乎達到極限，即使再增加提取溶劑也不能顯著地提高多酚提取得率。

2.2.2 正交試驗結果

2.2.2.1 因素水平設計。

根據2.2.1 單因素試驗結果，選定乙醇濃度、料液比、提取溫度，提取時間作為正交試驗的因素，各因素的水平如表1所示。

圖2 單因素試驗結果Fig.2 The result of single factor experiment

2.2.2.2 正交試驗結果

藕皮多酚類物質提取工藝的正交試驗結果如表2所示。

表2 藕皮多酚類物質提取正交試驗結果Table 2 The orthogonal experiment of polyphenol extraction from lotus skin

續表2 藕皮多酚類物質提取正交試驗結果Continue table 2 The orthogonal experiment of polyphenol extraction from lotus skin

從表2可以看出：各因素對多酚提取效果影響的主次順序依次為乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間＞料液比，利用IBM SPSS Statistics 22 進行分析得知：各因素對提取得率的影響均極顯著（P＜0.01）。根據正交試驗分析的結果，多酚提取得率最高的理論組合應為A1B3C3D1，而正交試驗最佳組合中實際多酚提取得率最高的工藝組合為A1B3C3D3。將理論組合A1B3C3D1進行試驗，所得到的結果與正交試驗最佳組合進行t 檢驗，兩者差異極顯著（P＜0.01）。考慮節省時間以及提取得率的因素，確定A1B3C3D1最佳工藝組合，即乙醇濃度40%、料液比 1∶30（g/mL）、提取溫度 90 ℃、提取時間2 h，此條件下多酚提取得率為（4.45±0.05）mg/g。和發表文獻[14]相比，本研究中多酚提取得率略低，這可能與研究所使用的蓮藕皮產地與品種[20]以及新鮮程度有關。隨后選用一批藕皮廢棄物，將其分別曬干（2 d）、烘干（60 ℃，6 h）、凍干（-40 ℃，12 h）后用高速粉碎機粉碎，過100 目篩，按照優化工藝進行多酚物質提取，多酚提取得率分別為（1.09±0.04）、（4.45±0.05）、（5.09±0.05）mg/g，經 t 檢驗，三者之間差異極顯著（P＜0.01）。這一試驗結果以及相關文獻[21-22]證實了多酚的穩定性受到原料處理方式、氧氣、光照等多種因素的影響。證實了曬干方法簡單無需設備和能量消耗，但需要大量場地，曬制受天氣因素影響大，時間長，且由于曬制過程中受陽光照射、氧氣等作用使得多酚物質氧化，造成多酚活性物質損失；烘干需要設備和能量的消耗，但能在較短時間內處理藕皮樣品，較大限度地保留多酚類活性成分；凍干設備成本較高，處理時間長，能最大限度地保留多酚類活性成分。3 種不同處理方式的試驗結果給藕皮多酚提取工業化生產提供了參考。

2.3 藕皮多酚提取物體外抗氧化能力

將得到的藕皮多酚提取物按比例進行稀釋，對其進行了抗氧化能力的檢測，并與抗壞血酸的抗氧化能力進行比較，結果見圖3。

圖3 藕皮多酚提取物體外抗氧化能力測定結果Fig.3 The antioxidant properties detection in vitro of polyphenol from lotus skin

圖3-A～C 顯示：1 mg/mL 的抗壞血酸對羥基自由基清除作用只有28.83%，而0.15 mg/mL 的藕皮多酚提取物對羥基自由基消除率達91.01 %，其IC50為0.026 mg/mL；0.3 mg/mL 的抗壞血酸對DPPH 自由基消除率為48.87%，而0.2mg/mL 的藕皮多酚提取物對DPPH自由基清除作用為81.39%，其IC50為0.020 mg/mL；0.05 mg/mL 的抗壞血酸對O2-自由基消除率為98.68%，而0.05 mg/mL 的藕皮多酚提取物對O2-自由基消除率為71.62%，其IC50為0.009 mg/mL。由此可知，藕皮多酚提取物對羥基自由基清除能力以及DPPH 自由基清除能力均優于抗壞血酸，而O2-自由基清除能力略差于抗壞血酸。

3 結論

本文以蓮藕加工中的藕皮廢棄物為原料，以乙醇溶液為提取劑進行了多酚物質的提取，得到最佳提取工藝，此外，體外抗氧化試驗結果顯示：藕皮多酚提取物對羥基自由基、DPPH 自由基消除率、O2-自由基消除率分別最高可達92.45%、82.11%、80.41%；證實藕皮多酚提取物具有很好的抗氧化能力。本研究對蓮藕加工中的廢棄物利用具有重要的參考價值，并在環境保護、減少污染等方面具有一定的社會意義。