8-氨基異紫堇堿對HO-8910PM增殖和遷移的抑制作用

紀 武，王圣坦，朱根海，賀國麗，洪 瀾，王 雁

卵巢癌(ovarian carcinoma,OC)發病隱匿，大多數患者就診時已處于中晚期[1]。近年來中草藥的天然有效成分抗癌效果引起了廣泛關注[2]，其中8-氨基異紫堇堿(8-amino-isocorydine,8-NH2-ICD)是從罌粟科植物禿瘡花中提取的以異紫堇堿為原料，經化合物化學結構衍生合成而來，通過對結構的進一步修飾。研究[3]顯示，8-NH2-ICD可抑制人肺癌(A549)、胃癌(SGC7901)、肝癌(HepG2)細胞系體外生長，小鼠體內實驗也表明異紫堇堿類衍生物為一種有效的抗癌劑且具有更低的毒副作用。該研究從腫瘤細胞增殖及遷移方面，探討8-NH2-ICD對體外培養人高轉移卵巢癌-8910PM(human high metastatic ovarian carcinoma-8910PM,HO-8910PM)細胞株的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人上皮OC細胞株HO-8910PM由中科院上海細胞庫提供，純度>99%，以高糖型DMEM(美國Gibco公司)培養液，加入10%標準胚牛血清(FBS，美國Gibco公司)、青-鏈霉素(美國Hyclone公司)，放置在37 ℃、5% CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養，在細胞生長至80%融合時，以0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)消化傳代。

1.1.2主要儀器與試劑 酶標儀(Promega多功能化學發光儀)購自美國普洛麥格北京生物技術有限公司；倒置熒光顯微鏡(Axio Observer A1)購自德國Lecia公司；FACS Calibur Cell Sorting System型流式細胞儀購自美國BD公司。細胞增殖/毒性檢測(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒購自美國Yeasen公司；細胞凋亡Hoechst染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1分組 取對數生長期的OC細胞株HO-8910PM進行檢測，試驗分為陰性對照組、藥物組，陰性對照組不經藥物處理，僅加10% FBS培養液，藥物組中藥物濃度梯度依次為5、10、20、40 μg/ml。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 在1.1.1 所述條件下對人上皮性OC細胞HO-8910PM進行培養，將對數生長期細胞移入96孔細胞培養板，細胞密度1×105個/ml，每孔加入200 μl細胞懸液，培養12 h見細胞貼壁后加入配置好的工作濃度藥液，各藥物濃度均設5個平行復孔，陰性對照組只加培養液，不加細胞。于酶標儀450 nm處測定各孔吸光度(optical density,OD)值，空白對照孔為調零孔。細胞增殖抑制率(%)=(1-藥物組OD值)/陰性對照組OD值×100%，實驗重復3次。

1.2.3Hoechst染色觀察HO-8910PM細胞凋亡形態 將生長穩定的HO-8910PM細胞傳代至6孔板中(底部放置一蓋玻片)，每孔細胞數量約105個，培養待細胞貼壁并覆蓋培養孔50%時，分別按陰性對照組、8-NH2-ICD 5、10、20、40 μg/ml 5個分組方式加藥處理至72 h，應用Hoechst染色試劑盒進行檢測，染色5 min吸去染色液，蓋上有細胞的蓋玻片制備臨時裝片并觀察細胞形態，細胞發生凋亡時，染色質固縮，Hoechst染色時細胞核呈致密濃染或碎塊致密濃染。

1.2.4流式細胞術檢測細胞周期 將培養細胞HO-8910PM以1×105個/ml密度接種在6孔板上，吸去培養基，加入2 ml 1640培養液及不同濃度8-NH2-ICD的1640培養液，每孔設立2個復孔。作用24 h后離心收集細胞，應用PBS洗滌1次，加入預冷70%乙醇固定過夜；第2天以2 500 r/min離心5 min，收集細胞，PBS洗滌1次，以0.5 ml PBS重懸，按照Cycle Test-Plus DNA Reagent Kit(美國BD公司)試劑盒說明書進行染色，以注射器吸取細胞懸液，經尼龍濾網過濾后上流式細胞儀，應用Mod Fit LT軟件分析各樣品中細胞周期分布情況。

1.2.5Transwell小室測定細胞遷移能力 將Matrigel以無血清培養基稀釋至50 μg/ml，每小室加50 μl，4 ℃冰箱過夜風干，第2天在超凈臺照射2 h，加入100 μl含10 μg/L牛血清白蛋白的無血清培養液濕化，對照組加入細胞培養液，其他各組加入不同濃度8-NH2-ICD，置于培養箱中培養，參照鄭愛文等[4]提出的方法評估細胞侵襲能力。本研究選擇陰性對照組、藥物組中40 μg/ml 8-NH2-ICD進行統計學分析。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制率檢測結果隨時間、藥物濃度增加，HO-8910PM細胞增殖抑制率增加(P<0.05)，在5～20 μg/ml范圍內有明顯量效、時效關系，至20 μg/ml時對細胞增殖抑制作用基本已達最大值。見表1。

2.2 細胞凋亡形態觀察結果細胞經Hoechst 33258染色后，于熒光顯微鏡下觀察，發現陰性對照組細胞呈彌散均勻的淡藍色熒光，添加8-NH2-ICD的細胞株出現細胞核固縮、熒光致密發亮、大小不同顆粒狀強藍色熒光等凋亡形態變化(如箭頭所示)，尤其隨8-NH2-ICD濃度增加，凋亡進程加快，染色質凝聚現象及凋亡小體明顯增多，凋亡小體釋放增多，細胞膜變形更明顯。見圖1。

2.3 細胞周期檢測結果流式細胞技術檢測結果顯示，8-NH2-ICD作用72 h后，與陰性對照組比較，濃度在5～20 μg/ml時對細胞周期作用不明顯，濃度為40 μg/ml時S期細胞減少，G0/G1期細胞比例增加，差異有統計學意義(P<0.05)，8-NH2-ICD對HO-8910PM細胞周期阻滯在G0/G1期。見表2、圖2。

表1 細胞增殖抑制率檢測結果

同一濃度與24 h比較：*P<0.05；同一濃度與48 h比較：#P<0.05；同一時點與5 μg/ml比較：△P<0.05；同一時點與10 μg/ml比較：▲P<0.05；同一時點與20 μg/ml比較：☆P<0.05

表2 細胞周期檢測結果

與陰性對照組比較：*P<0.05

圖1 培養72 h后
Hoechst染色結果×200

A：陰性對照組；B：8-NH2-ICD 5 μg/ml藥物組；C：8-NH2-ICD 10 μg/ml藥物組；D：8-NH2-ICD 20 μg/ml藥物組；E：8-NH2-ICD 40 μg/ml藥物組

表3 細胞遷移能力檢測結果個/視野,n=3)

與24 h比較：*P<0.05；與48 h比較：#P<0.05

2.4 細胞遷移能力檢測結果Transwell小室檢測結果顯示，處理24、48、72 h時藥物組侵襲至濾鏡下表面的細胞數明顯減少，且均低于陰性對照組，尤其是48、72 h時差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖3。

3 討論

OC發病率僅次于宮頸癌、乳腺癌，尋找新的治療方案迫在眉睫[5]。我國藥材資源豐富，尤其是西北地區天然草藥及其有效成分的抗病毒、抗癌效果已得到廣泛關注，其中禿瘡花具有清熱解毒、消腫止痛、殺蟲等功能，含有異紫堇堿、紫堇堿等活性成分[6]，研究[7]表明異紫堇堿不僅通過將細胞周期阻滯于G2/M期及誘導細胞凋亡而抑制肝癌細胞增殖，也能通過靶向誘導耐藥性側群細胞相關因子凋亡，但其有效劑量200 μmol/L于臨床治療而言為相對高劑量，為減少異紫堇堿劑量及改進抗癌活性，將異紫堇堿通過化學修飾、結構改造得到8-NH2-ICD。

8-NH2-ICD屬于前期篩選的異紫堇堿衍生物，易溶于水，且化學性質穩定，已有研究[8]表明8-NH2-ICD對人乳腺癌細胞、子宮頸癌細胞等癌細胞均有不同程度抑制作用。本研究選擇了具有較強侵襲及轉移生長潛能的人OC細胞株HO-8910PM進行研究，結果顯示隨時間、8-NH2-ICD藥物濃度增加，HO-8910PM細胞增殖抑制率增加，在5～20 μg/ml范圍內有明顯量效、時效關系，至20 μg/ml時8-NH2-ICD對細胞增殖抑制作用基本已達最大值，表明8-NH2-ICD對人OC細胞株HO-8910PM有明顯抑制作用，且在5～20 μg/ml范圍內呈時間與劑量依賴性，20 μg/ml時抑制作用最大，可將其作為理想治療劑量。

細胞凋亡是多種細胞調控機體發育、維護內環境穩定、由基因控制的細胞主動死亡過程，本研究中Hoechst 33258染色顯示，添加8-NH2-ICD的細胞株細胞核呈現固縮、熒光致密發亮等凋亡形態變化，隨8-NH2-ICD濃度增加，凋亡進程加快，染色質凝聚現象及凋亡小體明顯增多，細胞膜變形更明顯，因此8-NH2-ICD可較好促進HO-8910PM細胞凋亡，這與梁雪霏[9]的研究結論相近。流式細胞檢測顯示，8-NH2-ICD作用72 h后，與陰性對照組相比，濃度在5～20 μg/ml時對細胞周期作用不明顯，濃度為40 μg/ml時S期細胞減少，G0/G1期細胞比例增加， 8-NH2-ICD將HO-8910PM細胞周期阻滯在G0/G1期，這可能是因為該期細胞多處于DNA合成前期，絕大多數細胞處于靜止期，從而使細胞不能進入S期及G2/M期進行DNA合成，細胞分裂，導致細胞無法進入下一個合成周期，因此較好地抑制細胞增殖，促進其凋亡。癌細胞的侵襲與轉移特性為腫瘤細胞重要的生物學特征[10]，本研究表明，處理24、48、72 h時40 μg/ml藥物組侵襲至濾鏡下表面的細胞數明顯減少，且均低于陰性對照組，與閆倩[11]報道的8-NH2-ICD經異紫堇堿結構修飾后抗癌活性提高，可抑制腫瘤細胞生長的結論相符。因此8-NH2-ICD能有效抑制人OC細胞株HO-8910PM的遷移，發揮其抗腫瘤效應[12]，鑒于本研究HO-8910PM細胞株數量少，關于其作用機制仍有待深入研究。

圖2 培養72 h后流式細胞技術檢測結果

A：陰性對照組；B：8-NH2-ICD 5 μg/ml藥物組；C：8-NH2-ICD 10 μg/ml藥物組；D：8-NH2-ICD 20 μg/ml藥物組；E：8-NH2-ICD 40 μg/ml藥物組

圖3 細胞遷移能力檢測結果 ×200

A：陰性對照組；B：8-NH2-ICD 5 μg/ml藥物組；C：8-NH2-ICD 10 μg/ml藥物組；D：8-NH2-ICD 20 μg/ml藥物組；E：8-NH2-ICD 40 μg/ml藥物組

本實驗研究表明，8-NH2-ICD能通過將人OC細胞株HO-8910PM阻滯于G0/G1期而可較好抑制細胞的增殖、遷移，促進癌細胞凋亡，這為OC的治療提供了新途徑。