丙咪嗪經酸性鞘磷脂酶/神經酰胺通路抑制LPS誘導的RAW264.7細胞NLRP3炎癥小體的激活

蔣建軍，楊 進，金永梅，操基玉，陸友金

炎癥反應是病理情況下的局部保護過程，在機體受到外界刺激時，炎癥在先天免疫反應中起關鍵作用；然而，過度的炎癥反應通常導致組織損傷和機能障礙，如敗血癥、炎癥性腸病、牛皮癬等[1-2]。目前臨床上使用的大部分抗炎藥物都存在不容忽視的不良反應。因此，探索副作用更小且更加有效的抗炎藥物仍是該領域的迫切任務。NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3)炎癥小體是先天免疫系統中主要的細胞內炎性途徑[3]，NLRP3炎癥小體的過度激活引發白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18的過度釋放，進而促進過度的炎癥反應在多種炎癥相關疾病中被證實[4]。因此，NLRP3炎癥小體可以作為相關疾病預防和治療新靶點。

丙咪嗪是臨床上常見的三環類抗抑郁藥，具有抗炎、抗凋亡等藥理學作用[5]。已知丙咪嗪可顯著抑制酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASM)的活性，ASM是水解鞘磷脂產生神經酰胺(ceramide, Cer)的調控關鍵酶[6]。本課題組前期研究[5]顯示，在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的小鼠急性肺損傷中，使用丙咪嗪可顯著改善小鼠肺部炎癥反應，并提高小鼠存活率。然而，丙咪嗪是否通過對ASM/Cer通路的調控進而抑制NLRP3炎癥小體的激活并起到抗炎作用，目前仍不清楚。該研究采用LPS誘導的RAW264.7細胞作為體外炎癥模型，從NLRP3炎癥小體途徑研究丙咪嗪對炎癥反應的抑制作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 小鼠巨噬細胞系RAW264.7由安徽醫科大學公共衛生學院惠贈。

1.1.2主要藥品與試劑 LPS、丙咪嗪(美國sigma公司)；DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司)；BI胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶(江蘇碧云天生物技術有限公司)；CCK-8細胞活性測定試劑(合肥白鯊生物科技有限公司)；抗NLRP3抗體、抗caspase-1抗體、抗IL-1β抗體；抗IL-18抗體、抗ASM抗體(美國abcam公司)；抗Cer抗體(美國ENZO公司)；辣根過氧化物酶標記二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；小鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術有限公司)。

1.1.3儀器 CO2培養箱、酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；VE-180電泳儀、VE-186轉膜儀、凝膠成像儀(上海天能技術有限公司)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養、炎癥模型的構建 小鼠RAW264.7細胞為貼壁細胞，培養于含10%BI胎牛血清和1%抗生素(100 mg/L鏈霉素和100 mg/L青霉素)的DMEM培養基中，置于條件為37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中進行培養。待細胞處于對數生長期時，將LPS加入至培養液中致LPS的最終濃度為1 mg/L，使細胞成多角形形態以及偽足數量增加，建立成熟的炎癥模型。

1.2.2CCK-8法檢測細胞活性 將密度為1×108/L的RAW264.7細胞懸液加入至96孔板，每孔100 μl。設置空白組(空白組不加細胞，僅加入100 μl培養液)、對照組、丙咪嗪組(給藥濃度為20、40、60、80、100 μmol/L)，每組設置3個復孔。培養24 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續培養2.5 h后，用酶標儀在450 nm處測量各孔的吸光度，并計算細胞存活率。

1.2.3Western blot法檢測ASM、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達 RAW264.7細胞按分組處理8 h后，提取各組細胞總蛋白，通過BCA法檢測蛋白濃度。蛋白經凝膠電泳法分離后，再轉至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h TBS漂洗3次，每次10 min；加入說明書中指示的相應稀釋濃度的一抗，于4 ℃孵育過夜。次日TBST漂洗4次，每次10 min，然后加入二抗，室溫孵育1 h。TBST漂洗4次，每次10 min，ECL法顯影，使用Tanon圖像分析系統進行分析。

1.2.4ELISA法測定RAW264.7細胞上清液中IL-1β和IL-18含量 將處于對數生長期的RAW264.7細胞接種于24孔板，培養至細胞密度為80%左右，隨機設置空白對照組、LPS組(1 mg/L)、LPS+丙咪嗪組(20、40、60 μmol/L丙咪嗪預先處理RAW264.7細胞2 h后與1 mg/L LPS共同作用)。培養8 h后吸取上清液。根據ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測細胞上清液中IL-1β和IL-18的含量。

1.2.5免疫熒光技術檢測Cer表達 取對數生長期的RAW264.7細胞消化離心后，制成細胞懸液，調整細胞密度為5×107/L。于12孔板中各放入一個細胞爬片，取50 μl細胞懸液均勻抹于爬片上，貼壁2 h后加入1 ml培養液，培養24 h后吸取培養液。分別向各孔中加入終濃度為0、1 mg/L LPS、20 μmol/L丙咪嗪+1 mg/L LPS、60 μmol/L丙咪嗪+1 mg/L LPS(丙咪嗪預先處理RAW264.7細胞2 h后與1 mg/L LPS共同作用)的培養液1 ml，作用8 h。吸去培養液，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%TritonX-100破膜20 min, 0.1%的胎牛血清蛋白(BSA)封閉1 h。吸去封閉液后，加入PBS稀釋的Cer抗體(1 ∶50)，4 ℃孵育過夜。次日回收一抗，PBS清洗后加入由PBS稀釋的熒光二抗(1 ∶200)。避光室溫孵育1 h，吸去二抗，PBS清洗，DAPI染核，甘油封固，熒光顯微鏡下觀察并拍片。

2 結果

2.1 丙咪嗪對RAW264.7細胞活性的影響丙咪嗪在濃度為0～60 μmol/L范圍內對RAW264.7細胞無明顯毒性，其細胞活力與空白對照組相比差異無統計學意義，見圖1。

2.2 丙咪嗪對LPS誘導的RAW264.7細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達的影響與對照組比較，LPS明顯增加了細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達(P<0.01)；然而，給予丙咪嗪預處理可顯著抑制細胞中NLRP3(F=33.86,P<0.01)、caspase-1(F=96.05,P<0.01)、IL-1β(F=55.74,P<0.01)和IL-18(F=165.42,P<0.01)的蛋白表達，差異均有統計學意義，見圖2、3。

2.3 丙咪嗪對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放IL-1β和IL-18的影響與對照組相比，LPS明顯增加了細胞上清液中IL-1β(35.43±5.38)和IL-18(63.86±6.54)的含量(P<0.01)；然而，給予丙咪嗪預處理可顯著抑制細胞上清液中IL-1β和IL-18的釋放，差異均有統計學意義(F=29.52,P<0.01)、(F=42.95,P<0.01)；抑制的程度與其濃度有關，在丙咪嗪濃度為60 μmol/L時，IL-1β(17.41±2.51)和IL-18(38.42±3.86)的釋放抑制最明顯，見圖4。

圖2 丙咪嗪對LPS刺激的RAW264.7細胞中NLRP3和caspase-1蛋白表達的影響

A：Western blot檢測NLRP3、caspase-1蛋白表達；B、C：NLRP3、caspase-1蛋白相對表達量；與對照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.4 丙咪嗪對LPS誘導的RAW264.7細胞中ASM蛋白表達和Cer含量的影響與對照組相比，LPS顯著增加了細胞中ASM的蛋白表達(P<0.01)；然而，ASM抑制劑丙咪嗪可使其恢復至正常水平，差異有統計學意義(F=72.66,P<0.01)(圖5)。細胞免疫熒光檢測結果顯示，與對照組相比，LPS顯著增加了細胞中Cer的含量(P<0.01)；而丙咪嗪可顯著抑制LPS所致Cer改變，差異有統計學意義(F=201.16,P<0.01)(圖6)。

圖3 丙咪嗪對LPS刺激的RAW264.7細胞中IL-1β和IL-18蛋白表達的影響

A：Western blot檢測IL-1β、IL-18蛋白表達；B、C：IL-1β、IL-18蛋白相對表達量；與對照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01

圖4 丙咪嗪對LPS刺激的RAW264.7細胞中IL-1β、IL-18釋放量的影響

A：IL-1β；B：IL-18；與對照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01

圖5 丙咪嗪對LPS刺激的RAW264.7細胞中ASM蛋白表達的影響

與對照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01

圖6 丙咪嗪對LPS刺激的RAW264.7細胞中Cer生成的影響 免疫熒光染色×200

A：對照組；B：LPS組(1 mg/L)；C：LPS(1 mg/L)+丙咪嗪組(20 μmol/L)；D：LPS(1 mg/L)+丙咪嗪組(60 μmol/L)；與對照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：##P<0.01

3 討論

本研究結果表明，丙咪嗪通過對ASM/Cer通路的調控進而抑制NLRP3炎癥小體的激活并起到抗炎作用。該研究結果首次證明了丙咪嗪經NLRP3炎癥小體途徑起到抗炎作用，并且進一步揭示了ASM/Cer通路在NLRP3炎癥小體激活中的關鍵作用。

NLRP3炎癥小體在先天免疫系統中發揮著重要作用，大量研究[7]表明，NLRP3炎癥小體的激活與多種炎癥相關的疾病密切相關。因此，了解NLRP3炎癥小體激活的分子機制為炎癥性疾病提供新的診療思路具有重要意義。然而，大量研究[8]表明Cer在不同的病理條件下啟動NLRP3炎癥小體的形成和活化，包括胰島素抵抗，肥胖和急性肺損傷。Cer可通過鞘磷脂酶催化膜鞘磷脂的分解生成，或通過Cer合成酶從頭合成釋放[9]。在機體應激反應中，鞘磷脂被催化分解是最重要、最直接以及最快生成Cer的途徑，鞘磷脂酶是此途徑的調控關鍵酶。鞘磷脂酶包括三種同工酶：ASM、中性鞘磷脂酶(Mg2+dependent neutral sphingomyelinase, NSMase)和堿性鞘磷脂酶。其中ASM是被人們研究和認識最廣泛的，且ASM的生物活性占鞘磷脂酶總活性的90%，其對內源性Cer的生成具有重要作用[10]。丙咪嗪是臨床上常見的三環類抗抑郁藥，也是細胞動物實驗中常用的ASM抑制劑。課題組前期研究[5]發現，丙咪嗪可顯著改善由LPS誘導的小鼠急性肺損傷的肺部炎癥反應。然而，丙咪嗪是否通過對ASM/Cer通路的調控進而抑制NLRP3炎癥小體的激活并起到抗炎作用，目前仍不清楚。研究顯示，在LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應中，ASM的蛋白表達以及神經酰胺的含量明顯升高；然而，在給予ASM抑制劑丙咪嗪預先處理后，ASM的蛋白表達以及Cer的含量被顯著抑制。這一結果提示在LPS誘導的RAW264.7細胞中Cer的累積主要源于ASM的激活。進一步研究了丙咪嗪對NLRP3炎癥小體激活的影響，結果顯示，丙咪嗪顯著抑制了由LPS誘導的RAW264.7細胞中NLRP3、caspase-1的蛋白表達。因此，可以認為丙咪嗪作為ASM的抑制劑可通過對ASM/Cer通路的調控進而抑制NLRP3炎癥小體的激活。

IL-1β和IL-18是兩種非常重要的促炎因子，在炎癥反應中發揮重要作用，限制炎癥因子的表達便可實現抗炎作用。已經證實IL-1β和IL-18的分泌需要NLRP3炎癥小體的參與[7]。因此，本研究進一步檢測了由LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-1β和IL-18的蛋白表達以及細胞上清液中兩者的分泌水平。正如所預期的，在LPS刺激RAW264.7細胞后，細胞中IL-1β和IL-18的蛋白表達以及細胞上清液中兩者的分泌水平都顯著升高；然而，在給予丙咪嗪預先處理后，顯著抑制了兩者在細胞中的蛋白表達以及細胞上清液中兩者的分泌水平。這一結果表明丙咪嗪通過限制NLRP3炎癥小體的激活從而抑制IL-1β和IL-18的表達。

綜上，本研究表明ASM/Cer通路在NLRP3炎癥小體形成和活化中起關鍵作用，丙咪嗪作為ASM的抑制劑可通過對ASM/Cer通路的調控進而抑制NLRP3炎癥小體的激活并起到抗炎作用。然而，丙咪嗪對于LPS誘導炎癥反應的保護作用可能涉及其他機制，有待進一步深入研究。