亮菌口服液對5-FU化療后小鼠腸黏膜屏障及腸道菌群移位的影響

董文欽，朱耀東，李 平，張 梅

化療引起的腸黏膜屏障的損傷，又稱“化療性腸黏膜損傷”(chemotherapy-inducedintestinal mucosal injury, CIMI)，是目前癌癥化療中常見的副作用[1]。目前對CIMI的防治主要集中于控制癥狀，促進腸黏膜修復等，但許多藥物價格昂貴，效果欠佳[2]。亮菌是我國最早發現并擁有自主知識產權的一種真菌，經發酵提取的亮菌口服液(armillariella oral solution, AOS)常被用于臨床。研究[3]表明，AOS能夠明顯改善慢性胃炎、腸炎的臨床癥狀和體征。課題組前期研究[4]證實，AOS的主要成分亮菌多糖能緩解CIMI，其機制可能與抑制腸上皮細胞的凋亡有關，然而，CIMI作用機制復雜，其是否與腸黏膜屏障功能的調節有關，相關的研究報道較少。研究[5]表明，腸道菌群失調是5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)誘導CIMI中重要的作用機制之一，腸黏膜屏障的破壞使不同的病原體進入宿主，導致腸黏膜的損傷[6]。該研究通過建立化療性腸黏膜損傷模型，用AOS進行干預，檢測不同劑量AOS作用后腸黏膜屏障和菌群移位的情況，探討AOS對化療性腸黏膜損傷的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑C57BL/6小鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心，雌雄不拘，SPF級，體質量(17～22)g，4～6周，共36只。處于室溫22 ℃，濕度50%，通風環境良好。AOS購自合肥誠志生物制藥有限公司；雙歧桿菌三聯活菌片(combined bifidobacterium and lactobacillus tablets group,CBL )購自內蒙古雙奇藥業股份有限公司；5-FU購自天津金耀有限公司；異硫氰酸熒光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran, FITC-Dextran)購自西安瑞禧生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；麥康凱培養基和哥倫比亞血平板購自合肥天達診斷試劑有限公司。帶狀閉合蛋白(zonula occludens, ZO-1)小鼠單克隆抗體、咬合蛋白(occludin)小鼠單克隆抗體購自美國Proteintech公司；小鼠/兔聚合物法檢測系統購自北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.2 儀器ThermoFisher FC型全波長多功能酶標儀購自美國Thermo公司；AIR TECH型超凈工作臺購自蘇州市蘇凈集團安泰公司；DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海齊欣科學儀器有限公司；PYX-DHS型恒溫培養箱購自上海躍進醫療器械廠；全自動微生物分析儀(VITEK 2 Compact)購自法國Biomerieux公司；GFL1008型水浴鍋購自深圳市朗誠科技股份有限公司；LG300型光學顯微鏡購自無錫市朗伽生物醫學有限公司；RM2235型切片機購自德國萊克公司；Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件購自美國Media Cybernetics公司。

1.3 實驗分組及處理適應性喂養3 d后，將36只小鼠隨機分均為6組：正常組，模型組,雙岐桿菌組(450 mg/kg)[7]，亮菌口服液低劑量組(1 ml/kg)、中劑量組(5 ml/kg)、高劑量組(10 ml/kg)[8]。模型組、AOS組和雙歧桿菌組均接受5-FU腹腔注射7 d(50 mg/kg，第8～14天)，化療前2 h分別接受等體積生理鹽水、亮菌口服液及雙歧桿菌溶液灌胃，共14 d(第1～14天)。

1.4 檢測

1.4.1小鼠腸組織肉眼觀及光鏡下觀察 化療結束后24 h，頸椎脫臼法處死小鼠，取出十二指腸下端至回盲部腸管，觀察腸組織大體形態。取中段空腸2～3 cm，浸入4%多聚甲醛中，固定24 h。石蠟包埋、切片，常規HE染色，光鏡下觀察腸黏膜結構。

1.4.2FITC-Dextran示蹤法[9]檢測腸道通透性 實驗結束前4 h動物禁食水，應用FITC-Dextran灌胃(40 mg/100 g)，4 h后取血，肝素抗凝，3 500 r/min 離心10 min。取血漿25 μl加入100 μl PBS，用全波長多功能酶標儀測定其熒光強度，激發光波波長為488 nm，發射光波長為525 nm，制作標準曲線并計算樣品濃度。

1.4.3ELISA檢測血漿內毒素含量 取血，肝素抗凝，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取血漿，采用ELISA檢測內毒素含量，嚴格按照說明書步驟操作。

1.4.4腸道細菌移位檢測 CO2吸入麻醉小鼠后，無菌條件下摘取數個腸系膜淋巴結及肝、脾組織，稱取相同重量后無菌生理鹽水沖洗干凈置于無菌組織勻漿器中研磨，加入無菌生理鹽水稀釋成1 ml的勻漿液。取勻漿液100 μl，接種于麥康凱培養基平板，置于37 ℃恒溫箱中培養24 h，并用哥倫比亞血平板進行分離培養，VT2 compact鑒定，后計數不同組內臟器官發生腸道菌移位情況。凡是組織勻漿中培養出3個或3個以上腸道菌落即為陽性。

1.4.5免疫組化檢測腸組織緊密連接ZO-1、occludin蛋白的表達 按照免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法(streptomyces avidin-peroxidase,SP)操作，石蠟切片常規脫蠟、水化；0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)溶液98 ℃煮10 min抗原修復，過氧化物酶阻斷劑溫育10 min，洗滌，滴加一抗(抗ZO-1、occludin抗體稀釋度分別為1 ∶400、1 ∶400)，4 ℃冰箱孵育過夜，加HRP標記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗，37 ℃孵育20 min，洗滌，DAB顯色3 min，復染細胞核，脫水、透明，干燥后中性樹膠封片觀察。應用Image-Pro-Plus軟件進行圖像分析，分別測定緊密連接ZO-1、occludin蛋白的累積光密度(integrated optical density，IOD)。

2 結果

2.1 小鼠一般狀況及體質量變化正常組小鼠飲食、活動正常，受刺激后反應靈敏，毛發有光澤，體質量持續增加，大便正常。模型組小鼠化療后第5、6天，飲食及活動減少，受刺激后反應遲鈍，體質量明顯呈下降趨勢，有中度或重度腹瀉癥狀。與模型組比較，AOS中、高劑量組及雙歧桿菌組小鼠體質量減少程度降低(P<0.05)，腹瀉程度也減輕，受刺激反應和活動尚可；低劑量組與模型組相比，體質量變化差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠化療前后體質量變化

1：正常組；2：模型組；3：AOS低劑量組；4：AOS中劑量組；5：AOS高劑量組；6：雙歧桿菌組；與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.2 小鼠腸組織肉眼觀及光鏡觀察化療結束后24 h處死小鼠，取下整個小腸組織，肉眼觀察不同組小腸大體標本的變化。正常組小腸可見其腸管色澤鮮嫩，呈淡黃色，彈性良好，無充血、水腫等表現，而模型組小腸腸管呈黑紅色改變，彈性差，充血水腫明顯；亮菌口服液高劑量組及雙歧桿菌組可見腸管損傷明顯減輕，腸腔輕、中度水腫，無明顯出血，彈性尚可。見圖2。

圖2 各組小鼠腸組織肉眼觀察

圖3 各組小鼠腸組織光鏡觀察 HE×200

HE染色檢測空腸組織病理學改變。與正常組相比，模型組有嚴重的組織損傷，包括絨毛的萎縮，變形或者消失，腸隱窩加深，甚至丟失，炎癥細胞的浸潤，空泡化和水腫(圖3B中a示絨毛的萎縮，水腫，b 大量炎癥細胞浸潤，c 隱窩結構的丟失)。然而，中劑量組絨毛高度有所恢復，隱窩變淺，炎癥細胞浸潤減少，高劑量組絨毛高度恢復，隱窩排列整齊，各層結構相對清晰完整。由此提示AOS可緩解5-FU誘導的腸黏膜損傷，尤以中、高劑量組效果明顯。另外，雙歧桿菌組腸黏膜的損傷也明顯緩解。見圖3。

2.3 各組小鼠血漿FITC-Dextran濃度及細菌內毒素含量的測定與正常組比較，模型組小鼠血漿中FITC-Dextran的濃度明顯增加，內毒素含量也升高(P<0.05)；與模型組比較，AOS組FITC-Dextran濃度及內毒素含量下降，且中、高劑量組及雙歧桿菌組下降明顯(P<0.05)，而低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腸黏膜通透性檢測指標比較

與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.4 腸道菌群臟器移位率的測定正常組小鼠各臟器并無腸道菌群移位現象，而模型組小鼠內臟器官出現較多細菌移位現象。與模型組比較，給予AOS后，小鼠內臟器官腸道菌移位率顯著下降，尤以中、高劑量AOS明顯，差異有統計學意義(P<0.05)；雙歧桿菌組內臟器官移位率也明顯下降(P<0.01)。提示AOS緩解腸黏膜炎癥可能與減少小鼠腸道細菌移位有關。見表2。

表2 各組小鼠臟器腸道菌群移位情況

與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.5 各組小鼠腸組織中ZO-1、occludin蛋白的表達腸道緊密連接蛋白位于相鄰細胞頂側，ZO-1蛋白位于細胞膜內，occludin蛋白位于細胞膜外，胞質內也可見分布，免疫組化染色后陽性表達為棕黃色顆粒沿膜連續分布。與正常組比較，模型組可見棕黃色顆粒染色變淺、減少，成弱陽性，分布不連續，緊密連接蛋白表達明顯減少；與模型組比較，AOS組棕黃色顆粒增多，染色增強，沿膜連續分布，ZO-1及occludin蛋白的表達增加。見圖4、圖5。半定量分析IOD值，模型組蛋白表達明顯低于正常組(P<0.01)；AOS中、高劑量組與模型組比較，蛋白表達明顯增高(P<0.01)。見圖6A、6B。

圖4 各組小鼠腸組織中ZO-1蛋白的表達 免疫組化×400

圖5 各組小鼠腸組織中occludin蛋白的表達 免疫組化×400

圖6 各組小鼠腸組織中ZO-1、occludin蛋白的表達

A：ZO-1蛋白陽性表達；B：occludin蛋白陽性表達；1：正常組；2：模型組；3：AOS低劑量組；4：AOS中劑量組；5：AOS高劑量組；6：雙歧桿菌組；與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

3 討論

腸黏膜炎是癌癥化療的常見并發癥和劑量限制性毒副作用,但是到目前為止，仍然缺乏有效的治療策略。越來越多的研究[10]表明，傳統中醫藥能夠減輕化療相關副作用。AOS是從一種真菌-亮菌中分離、純化，培養后精制而成的中藥制劑，其主要成分是亮菌甲素和亮菌多糖，具有解痙、消炎、保肝、降酶、抗腫瘤、免疫調節、促進造血功能恢復等作用[11]。本研究在課題組前期研究基礎上，進一步探討AOS對CIMI的保護作用及可能的作用機制。

化療誘導的腸黏膜炎作用機制涉及眾多環節，其中腸黏膜屏障的破壞，導致功能的缺失，從而使有害物質侵入，也較為關鍵。機械屏障是腸黏膜重要屏障之一，主要由黏膜表面的粘液層、腸上皮細胞及其緊密連接、黏膜下固有層等組成。而腸上皮緊密連接是腸腔和黏膜之間的電荷和分子大小選擇性屏障，在調節腸上皮細胞的通透性方面起重要作用[12]。其主要由咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、連接黏附分子、帶狀閉合蛋白ZO 家族(ZO-1、ZO-2 和ZO-3)及與其相連的細胞骨架蛋白等組成[12]。緊密連接蛋白減少、缺失或移位，腸道通透性增加，可引起化療性腸黏膜炎、壞死性小腸結腸炎，炎癥性腸病[13]等疾病。本研究顯示，給予AOS后，腸道緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達較模型組明顯升高。FITC-Dextran是一種低分子多聚糖，正常情況下，小鼠體內不含FITC-Dextran且不被小腸吸收，經胃管進入消化道的FITC-Dextran進入血液循環的唯一方式便是破壞腸道屏障的完整性。血漿中的熒光強度愈強，FITC-Dextran的濃度愈高，提示腸黏膜屏障損害越嚴重。本研究也顯示，AOS干預后，血漿中FITC-Dextran濃度降低。這些結果提示，AOS對腸黏膜的機械屏障有保護作用，能降低腸上皮細胞的通透性，緩解腸黏膜的損傷。

腸黏膜的生物屏障主要由正常的腸道菌群構成，正常情況下這些菌群間相互制約，并與宿主之間維持相對穩定?；熕幬镒饔煤螅c道菌群與宿主之間的平衡被打破，腸道中的菌群或細菌代謝產物透過黏膜屏障，轉移到腸系膜淋巴結和腸腔外其他器官或部位，這一過程也稱為細菌移位[14]。本研究結果顯示，給予AOS后，血漿中內毒素含量及菌群移位率明顯下降，提示AOS明顯改善了化療后小鼠腸道菌群移位的情況。

綜上所述，AOS可能是通過抑制腸道緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達，降低腸道黏膜的通透性，進而抑制細菌及內毒素的移位，緩解化療后損傷的腸黏膜。然而，有研究[15]表明，化療藥作用后腸道內菌群的結構發生了變化，是否AOS緩解CIMI也與調節腸道菌群的平衡有關，需待進一步研究。