竹?魚微衛星標記開發及跨物種擴增

梁鎮邦，吳仁協，牛素芳，羅惠桂

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竹?魚微衛星標記開發及跨物種擴增

梁鎮邦，吳仁協，牛素芳，羅惠桂

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）

【目的】篩選高多態性竹?魚（）微衛星（SSR）標記，并驗證其在鲹科魚類中的通用性?！痉椒ā坎捎肧LAF-seq技術識別竹?魚基因組SSR標記，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳篩選高多態性位點，并進行跨物種PCR擴增。【結果與結論】識別出43 264個二至六堿基重復SSR標記，二、三堿基重復SSR標記較多（90.33%）。篩選出37個多態性的二、三堿基SSR位點，各位點的等位基因數為4 ~ 26，期望雜合度為0.481 ~ 0.935，多態信息含量為0.440 ~ 0.934。有30個位點符合哈迪-溫伯格平衡，且各位點間不存在連鎖不平衡現象。共有28個竹?魚SSR標記可在1種以上鲹科魚類中有效擴增，分別有24、21、20、19和11個SSR位點可在藍圓鲹（）、長身圓鲹（）、無斑圓鲹（）、頜圓鲹（）及金帶細鲹（）中穩定擴增，可為竹?魚遺傳資源評估和部分鲹科魚類的系統進化分析提供重要遺傳物質基礎及有力的分析手段。

竹?魚；微衛星標記；跨物種擴增；SLAF-Seq技術

竹?魚（）隸屬鱸形目（Perciformes）鲹科（Carangidae）竹?魚屬(），廣泛分布于西北太平洋，為暖水性中上層重要經濟魚類[1]。21世紀初，中國竹?魚的年均捕撈量約為3.4萬t，2008年捕撈量達最高峰，約為5.9萬t[2]。隨著底層、高營養級魚類資源的衰退，竹?魚的捕撈壓力逐漸增加，已出現小型化、生長加快等生物學特征退化現象[3-5]。目前，有關竹?魚的研究主要集中在漁業資源、攝食習慣、生物學特征及食品加工等方面[6-10]，而關于其分子標記和種質資源遺傳背景調查的研究報道較少。在種質資源遺傳學研究方面，Song等[11]利用線粒體控制區研究表明，日本沿海、中國福建和北部灣的竹?魚群體可能是單一的隨機交配群體；Zhao等[12]基于AFLP分析認為，竹?魚日本沿海和中國北部灣群體間無明顯的遺傳分化。在微衛星標記方面，僅Dae等[13]采用富集文庫法開發出10個二堿基重復序列的竹?魚微衛星位點。竹?魚種群遺傳資源研究需要大量高多態性、類型多樣化的微衛星標記，而已開發的10個微衛星位點遠不能滿足需求。因此，急需開發更多類型豐富的多態性微衛星位點。

微衛星DNA亦稱為簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR），在真核生物基因組中分布廣泛（每隔10 ~ 50 kb即有1個SSR），其側翼序列較為保守，而核心序列存在高度變異[14]，現已廣泛應用于海洋生物的種質資源評估、遺傳圖譜構建和系統進化等研究[15-18]。目前，有多種SSR標記開發方法。隨著測序技術的快速發展，高通量測序技術逐漸取代基因組文庫篩選法、富集文庫法等傳統SSR開發方法?；诟咄繙y序平臺的特異性擴增片段測序（Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq）技術成本低、周期短、測序深度高，是一種性價比高、適用范圍廣的SSR開發方法[19-20]，已成功用于帶魚（）[21]、沙帶魚（）[22]和藍圓鲹（）[23-24]等多種海洋魚類的SSR標記開發。

本研究采用SLAF-seq技術識別竹?魚基因組DNA中的SSR位點，以開發出多態性高、類型豐富的SSR標記，并檢測其開發的標記在藍圓鲹、長身圓鲹（）、無斑圓鲹（）、頜圓鲹（）及金帶細鲹（）等鲹科魚類中的通用性。研究結果可為竹?魚群體遺傳學研究和種質資源評估提供多樣化和高分辨力的分子標記，也可為相關鲹科魚類的系統進化研究提供新的分析手段。

1 材料與方法

1.1 樣品與DNA提取

竹?魚（32尾）于2015年4月采自廣東江門上川島，無斑圓鲹（2尾，三亞）、長身圓鲹（8尾，文昌和三亞）、頜圓鲹（1尾，南沙）、藍圓鲹（6尾，汕頭和廣東雷州珍稀海洋生物國家級自然保護區）和金帶細鲹（3尾，廣東雷州珍稀海洋生物國家級自然保護區）系2014―2016年春季采集于南海北部各漁港。取其背部肌肉，置于體積分數95%酒精中，于-20 ℃下保存備用。參照《分子克隆實驗指南》[25]，采用傳統酚-氯仿法提取樣品基因組DNA。

1.2 SLAF-seq測序

將1個竹?魚肌肉樣品送至北京百邁客生物科技有限公司，采用SLAF-seq技術進行SSR標記開發，參照Sun等[19]和Niu等[24]的方法構建基因組文庫、評估測序質量和識別微衛星位點等。從較為豐富的二、三堿基重復SSR標記中隨機挑選出200個重復次數為7 ~ 20、側翼序列較長的SSR位點，利用Primer 3.0設計各位點引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 SSR引物多態性

隨機選取6尾竹?魚的基因組DNA作為模板，對200對SSR引物進行多態性篩選。PCR體系包括：1.5 μL 10×PCR Buffer，0.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL正反引物（10 μmol/L），1 μL DNA模板（10 ~ 50 ng）和1.5 μLDNA聚合酶。反應條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，62 ~ 52 ℃30 s（每循環降1 ℃），72 ℃30 s，共25個循環；最后72 ℃下延伸10 min。PCR產物通過聚丙烯凝膠電泳統計樣品擴增成功率和條帶數，選擇出現3條或以上特異性條帶的位點。

1.4 多態性引物PCR和分型檢測

參考Schuelke[26]的三引物法進行多態性引物PCR。在多態性SSR位點的正向引物5′ 端添加M13序列（5′-AGGGTTTTCCCAGTCACG-3′或5′-GAG CGGATAACAATTTCACAC-3′），合成M13標記引物，同時合成相同序列的M13通用引物（用FAM或HEX熒光基團修飾其5′ 端）。通過梯度PCR（52 ~ 62℃）摸索M13標記引物的最適退火溫度，利用最適退火溫度對32個竹?魚樣品進行擴增。PCR體系：2 μL 10×PCR Buffer，0.5 μL dNTP（10?mmol/L），0.1 μL M13標記引物（10 μmol/L），0.6 μL反向引物（10 μmol/L），0.6 μL M13通用引物（10 mmol/L），1 μL DNA模板（10 ~ 50 ng）及1.5 μLDNA聚合酶。PCR反應條件：95 ℃5?min；95 ℃30 s，（52 ~ 62 ℃）30 s，72 ℃30 s，共26個循環；最后72 ℃下延伸10 min。PCR產物送至天一輝遠生物科技有限公司進行毛細管電泳分型檢測。

1.5 跨物種通用性檢測

將篩選出的多態性竹?魚SSR引物對頜圓鲹（= 1）、長體圓鲹（= 8）、無斑圓鲹（= 2）、金帶細鲹（= 4）、藍圓鲹（= 6）等5種鲹科魚類進行通用性檢測。PCR體系和擴增程序同1.4，采用聚丙烯凝膠電泳檢測PCR產物。膠圖中有1條以上等位基因條帶的位點視為通用位點。

1.6 數據分析

通過Micro-Checker v.2.2.3[27]檢測等位基因數據的準確性，確認無誤后，進行無效等位基因頻率（ua）評估及后續的數據分析。利用GenAlEx 6.503軟件[28]計算各位點的等位基因數（a）、有效等位基因數（e）、表觀雜合度（o）和期望雜合度（e），采用Cervus 3.0.7[29]軟件計算多態信息含量（PIC），使用GenePop 4.3[30]計算Hardy-weinberg平衡（HWE）、近交系數（is）以及連鎖不平衡檢測。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果

SLAF測序產生6.11×106原始數據（reads），其中GC含量為43.09%，符合測序質量要求（堿基質量值> 30）的堿基占80.86%。經識別和過濾，共獲得3.16×106個SLAF標簽，測序深度為13.26×。MISA軟件共識別出43 264個SSR位點，其中二堿基重復SSR（Di-nucleotide）29 457個（68.09%），三堿基重復SSR（Tri-nucleotide）9 623個（22.24%），四堿基重復SSR（Tetra-nucleotide）2 939個（6.79%），五堿基重復SSR（Penta-nucleotide）956個（2.21%），六堿基重復SSR（Hexa-nucleotide）289個（0.67%）。

2.2 多態性SSR位點篩選

基于6個竹?魚基因組DNA，從200個二、三堿基重復SSR位點中初步篩選多態性位點。結果顯示，26個位點無擴增條帶，71個位點擴增出1條特異性條帶，53個位點擴增出2條特異性條帶，分別有20、22、4、4個位點擴增出3、4、5、6條特異性條帶。

最后挑選出50個可擴增出3條或以上特異性條帶的SSR標記合成M13標記引物，并在32尾竹?魚中進行PCR擴增，最終36個多態性SSR位點能在27 ~ 32個竹?魚樣品中穩定地擴增出特異性條帶，1個位點（TJ2-20）僅在19個樣品中擴增出特異性條帶。37個SSR位點的GenBank登錄號為MK357853―MK357889（表1、2）。

2.3 竹?魚SSR標記多態性分析

各位點的遺傳多樣性數據如表2所示。37個SSR位點在32個竹?魚樣品中共檢測到508個等位基因，平均等位基因數為13.73，其中TJ2-39位點的等位基因數最少（a= 4），TJ2-24位點的等位基因數最多（a= 26）；有效等位基因數為2.002 ~ 15.929，平均6.90。16個位點的等位基因數與有效等位基因數之間的差值小于6，說明這些SSR位點的等位基因在被測群體基因組中的分布比較均勻。期望雜合度為0.481 ~ 0.935，平均值為0.807；觀測雜合度為0.508 ~ 0.955，平均值為0.739。多態信息含量為0.440 ~ 0.934，平均值為0.771。經Bonferroni校正后，TJ2-10、TJ2-11、TJ2-17、TJ2-23、TJ2-36和TJ2-44位點偏離哈迪-溫伯格平衡（< 0.001 4），這6個位點均具有較高的無效等位基因頻率（ua= 0.049 8 ~ 0.189 2）和近交系數（is= 0.131 0 ~ 0.433 4），其他31個位點間不存在連鎖不平衡現象。

表1 37個竹?魚SSR標記信息

表2 37個竹?魚SSR位點的群體遺傳學特征

注：a：退火溫度；：樣品數；*：經Bonferroni校正后顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(= 0.05,< 0.001 4)

2.4 跨物種擴增

37個竹?魚SSR位點的跨物種擴增結果如表3所示。有28個SSR位點可在1種以上鲹科魚類中進行有效擴增（占已開發位點的75.68%），其中6個位點可在5種鲹科魚類中擴增，7個位點可在4種鲹科魚類中擴增，5個位點可在3種鲹科魚類中擴增，5個位點可在2種鲹科魚類中擴增，5個位點可在1種鲹科魚類中擴增。其中，竹?魚SSR位點在藍圓鲹和長身圓鲹中的通用性較佳，擴增成功率分別為64.86%和56.76%；在無斑圓鲹和頜圓鲹中的通用性次之，擴增成功率分別為54.05%和51.35%；而在金帶細鲹中的通用性較差，擴增成功率為29.73%?？梢?，竹?魚SSR位點的側翼序列在部分鲹科魚類中有一定保守性。

表3 37個竹?魚SSR位點在5種鲹科魚類中的跨物種擴增

注:，樣品數；+，可擴增；-，不可擴增；AL，可擴增率（%）；括號里為等位基因數

3 討論

3.1 SLAF-seq技術開發SSR標記

本研究獲得的竹?魚基因組測序質量30為80.86%，GC含量為43.09%，表明用SLAF-seq技術獲得的基因組數據質量較佳，可用于后續SSR位點開發。在竹?魚基因組中共獲得39 080個（90.33%）常見的短堿基重復SSR（二堿基和三堿基），亦檢測出4 184個（9.67%）相對稀少的長堿基重復SSR（四至六堿基）。而傳統的SSR開發方法獲得的SSR類型基本是二堿基或復合二堿基，且數量較少。如Dae等[13]通過磁珠富集文庫法僅獲得10個竹?魚二堿基重復SSR位點，Cristian等[31]利用磁珠富集文庫法開發出8個智利竹?魚（）SSR位點（二堿基4個、復合二堿基1個、三堿基2個、4堿基1個）。可見，本研究利用SLAF技術開發出的SSR數量和類型遠超傳統的SSR開發方法，表明基于高通量測序的SLAF技術是較為快速、高效的SSR分離方法。

在本研究隨機挑選的200個SSR位點中，有174個（87%）位點可擴增出1條以上特異性條帶；在可擴增出3條或以上特異性條帶的50個位點中，有36個（72%）多態性位點可在27 ~ 32個竹?魚樣品中穩定擴增出特異性條帶，表明竹?魚SSR開發成功率較高，提示本研究所獲得的43 264個SSR位點標記開發潛力可能較高，可為后續篩選出高多態性的SSR標記提供充足的遺傳物質來源基礎。

3.2 SSR標記的多態性及其遺傳學特征

遺傳多樣性分析可反映群體內遺傳變異情況，可作為篩選優良SSR位點判斷依據。Barker[32]和Botstein等[33]認為，若SSR標記多于26個，每個標記至少有4個等位基因數，且每個標記多態性信息含量較高（PIC > 0.5），可認為遺傳多樣性分析結果較為可信且研究群體遺傳多樣性較豐富。本研究中，各位點平均等位基因數為13.73，平均多態信息含量為0.772，表明廣東江門群體遺傳變異水平較高。

本研究中，竹?魚SSR位點平均等位基因數、雜合度、多態信息含量高于Cristian等[31]開發的8個智利竹?魚二堿基重復SSR位點(a=10.88，o=0.709，e=0.786)和張浩冉等[22]開發的28個沙帶魚二、三堿基重復SSR位點(a= 9.11，o= 0.634，PIC= 0.670)，但與Dae等[13]開發的10個竹?魚二堿基重復SSR位點(a=14，o=0.695，e=0.805)、Galleguillos等[34]開發的9個智利竹?魚四堿基重復SSR位點（a= 13.75，o= 0.808，e= 0.875）和翟云等[23]開發的31個藍圓鲹四、五堿基重復SSR位點(a= 13.48，o= 0.650，PIC= 0.803)相當，表明本研究所開發竹?魚SSR標記多態性和分辨力均較高。

經Bonferroni校正后，共有6個SSR位點偏離哈迪-溫伯格平衡，可能與有無效等位基因、近親交配、自然選擇及種群退化等相關[35-36]。6個位點近交系數（0.131 ~ 0.433）和無效等位基因頻率（0.050 ~ 0.189）均較高，故可認為二因素是造成6個位點偏離哈迪-溫伯格平衡的重要原因。其次，竹?魚的捕撈壓力日益增大，海洋環境逐漸惡化，可能導致自然選擇壓力逐漸增大，進而引發竹?魚呈繁殖率上升、壽命縮短、體型變小等種群退化現象[4,37]。因此，自然選擇和種群退化也可能是這6個位點偏離哈迪-溫伯格平衡的因素。此外，楊君等[38]基于SSR標記分析刺槐葉癭蚊（）遺傳多樣性指數與樣本量的相關性發現，樣本量小于25時，對平均等位基因數、有效等位基因數及觀測雜合度均有較明顯影響。本研究中，TJ2-20位點的有效擴增個體數為19，可認為該位點遺傳多樣性參數存在一定偏差。發生變異的SSR位點側翼序列和有缺陷引物可降低引物與位點側翼序列的匹配度，可能是TJ2-20位點的有效擴增個體數偏少的重要原因。

綜上，本研究開發的37個竹?魚SSR位點有較高的分辨力和多態性水平，其中30個位點符合哈迪-溫伯格平衡，可為竹?魚種質資源評估和遺傳學研究提供有力工具和技術支撐，而偏離哈迪-溫伯格平衡的6個SSR位點和有效擴增個體數少于25的SSR位點需謹慎使用。

3.3 SSR標記的跨物種擴增

Primmer等[39]提出，SSR標記的跨物種擴增成功率與物種間的遺傳分化程度呈負相關?；诰€粒體COI和Cyt的遺傳距離顯示，竹?魚與藍圓鲹、長身圓鲹、無斑圓鲹、頜圓鲹、金帶細鲹的遺傳距離分別為0.1081、0.1274、0.1282、0.1336、0.1695[24]。而37個竹?魚SSR位點在這五種鲹科魚類中的跨物種擴增成功率依次為藍圓鲹64.86%、長身圓鲹56.76%、無斑圓鲹54.05%、頜圓鲹51.35%、金帶細鲹29.73%?？梢姡?魚SSR位點在幾種鲹科魚類中的跨物種擴增成功率與種間遺傳距離明顯呈反比，結果進一步支持了Primmer等[39]的結論。

跨物種擴增可為近緣物種提供SSR位點信息，降低SSR開發成本、減少工作量，且更易于獲得高多態性的SSR標記，是SSR標記獲取途徑中較經濟方便的方法之一。本研究中，分別有24、21、20、19、11個竹?魚SSR位點可在藍圓鲹、長身圓鲹、無斑圓鲹、頜圓鲹及金帶細鲹中穩定擴增，這些位點可為5種鲹科魚類的群體遺傳學等相關研究提供直接的標記來源。18個位點可在3 ~ 5種鲹科魚類中穩定擴增，說明這些位點在部分鲹科魚類中保守性較高，可為部分鲹科魚類系統進化研究提供有力的技術支持。

4 結論

基于SLAF-seq技術，共檢測到43 264個二至六堿基重復SSR位點，所得SSR開發成功率較高，可為篩選高質量SSR標記及種質資源研究提供重要遺傳物質基礎。從200個二、三堿基重復SSR標記中成功開發出37個竹?魚SSR位點，其中30個SSR位點遺傳信息含量較高，可為竹?魚種質資源評估提供有力的分析手段。28個竹?魚SSR位點在藍圓鲹、長身圓鲹等魚類中有通用性，可為5種鲹科魚類的群體遺傳學和系統進化研究等提供新的分子標記。

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Microsatellite Loci Development inby SLAF-seq Technology and Cross-amplification in Five Carangidae Fishes

LIANG Zhen-bang, WU Ren-xie, NIU Su-fang, LUO Hui-gui

（,,524088,）

【Objective】 To develop polymorphic microsatellite markers forand assess their transferability in five Carangidae fishes.【Methods】 The specific-locus amplified fragment sequencing (SLAF-seq) technology was employed to mine the genomic information and isolate microsatellite loci in. Microsatellite polymorphism and cross-amplification were explored by capillary electrophoresis and polyacrylamide gel electrophoresis, respectively.【Result and Conclusion】 SLAF-seq identified 43 264 di- to hexa-nucleotide repeat microsatellites, of which di-nucleotide and tri-nucleotide repeat loci were the most frequent (90.33%).Furthermore, 37 primer pairs of di- and tri-nucleotide repeat loci were successfully designed and exhibited polymorphism. The number of alleles per locus ranged from 4 to 26. The expected heterozygosity and polymorphism information content ranged from 0.481 to 0.935 and from 0.440 to 0.934, respectively.Thirty microsatellite markers were consistent with the Hardy-Weinberg equilibrium and showed no linkage disequilibrium. A total of 28 SSR markers forcould successfully cross-amplify in at least one species of Carangidae.A total of 24, 21, 20, 19, and 11 out of 37 microsatellite loci could cross-amplify in,,,and, respectively. These microsatellite markers could provide a powerful molecular tool for the genetic resource assessment ofand phylogeny study of the related Carangidae species.

; microsatellite loci; cross-species amplification; SLAF-seq

Q78；Q959.483.3

A

1673-9159（2019）04-0005-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.002

2019-03-03

廣東省自然科學基金-博士啟動資助項目（2016A030310329）；廣東海洋大學優秀青年骨干教師培養計劃資助項目（HDYQ2017002）；廣東海洋大學科研啟動費資助項目（R17040）；廣東省科技計劃資助項目（2017A030303077）；廣東省海洋和漁業發展專項（科技攻關與研發, A201708D07）

梁鎮邦（1994—），男，碩士研究生，研究方向為魚類生物多樣性與系統進化。E-mail: liangzhenbang0403@163.com

牛素芳（1987—），女，講師，博士，研究方向為魚類種群遺傳學和進化基因組學。E-mail: wolf0487@126.com

梁鎮邦，吳仁協，牛素芳，等. 竹?魚微衛星標記開發及跨物種擴增[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（4）：5-12.

（責任編輯：劉慶穎）