馬氏珠母貝TRADD基因克隆與組織表達分析

何軍軍，梁海鷹，陳 崧，房曉宸，黃雪敏

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馬氏珠母貝基因克隆與組織表達分析

何軍軍，梁海鷹，陳 崧，房曉宸，黃雪敏

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）

【目的】克隆馬氏珠母貝（）腫瘤壞死因子受體相關死亡域蛋白（TRADD）基因，并分析其在各組織中的表達?！痉椒ā坷胏DNA末端快速擴增技術(RACE)克隆獲得馬氏珠母貝基因的cDNA全長序列，利用實時熒光定量PCR（qPCR）方法分析基因在馬氏珠母貝不同組織中的表達模式。【結果與結論】包含5′非編碼區101 bp，3′非編碼區144 bp和開放閱讀框（ORF）591 bp，編碼196個氨基酸。序列分析表明，PmTRADD沒有信號肽和跨膜結構域，C端含有一個死亡結構域（DEATH）。將PmTRADD死亡結構域的氨基酸序列與其他物種的TRADD死亡結構域序列進行比對，發現不同物種的TRADD死亡結構域序列同源性較低。在馬氏珠母貝各組織中均有不同程度表達，在鰓組織中表達最高，肝胰腺次之，閉殼肌中基本無表達。

馬氏珠母貝; 腫瘤壞死因子受體相關死亡域蛋白; 基因克隆; 實時熒光定量

馬氏珠母貝()最早發現于廣西合浦縣，其肉質鮮美、所產珍珠具有非常高的觀賞價值和藥用價值[1]。隨著珍珠養殖業發展, 養殖規模不斷擴大, 種質退化和病害問題日趨嚴重, 海水珍珠產量和質量顯著下降, 嚴重威脅我國海水珍珠產業的持續健康發展[2]。因此, 研究貝類免疫相關基因, 了解貝類免疫防御機制至關重要。

腫瘤壞死因子受體相關死亡域蛋白 (tumor necrosis factor receptor associated death domain protein, TRADD) 是一種含死亡域 (death domain, DD) 的接頭蛋白, 是TNF受體-1（TNFR1）介導的TNF信號傳導的重要介質，在TNFα介導的程序性細胞凋亡中至關重要[3]。TRADD蛋白含有功能未知的N末端區域和C末端死亡結構域，與TNFR1的死亡結構域有23% 的相同之處[4]。TRADD的過表達可激活TNFR1樣信號通路，用于細胞凋亡和轉錄因子NF-κB的激活，在TNFR1應答中發揮作用[5]。細胞凋亡在發育和免疫反應中也起重要作用。在必要的情況下，生物體利用死亡信號消除威脅其存活的個體細胞，細胞因子如Fas配體和TNFα，可作為死亡信號與靶細胞表面的死亡受體結合，從而傳遞凋亡信號[6]，隨后TRADD與受體死亡結構域結合并主要負責其它效應蛋白的募集，如RIP1（受體相互作用蛋白1）、TRAF2（TNF受體-相關因子2）與TNFR1信號復合物、FADD（Fas相關蛋白與死亡域）對TNFR1誘導的二級復合物進行招募[4-5,7-9]。這些銜接蛋白的募集導致MAP激酶和NF-κB的激活，也觸發其他信號通路，包括細胞死亡，促炎反應等[8,10]。在日本腦炎病毒（JEV）實驗中已經表明，神經元中TNFR-1的表達模式在JEV感染后發生變化，并且是通過腫瘤壞死因子受體相關死亡結構域（TRADD）啟動死亡級聯的[11-12]。此外，TRADD與TNFR1、TRAF的相互作用是通過其死亡結構域與二者結合發生效應，因此，TRADD可能同時結合TNFR1和TRAF，從而將TRAF募集到TNFR1復合物中[4]。

近年來，TRADD蛋白的很多研究主要集中在脊椎動物的免疫功能中，例如在小鼠模型中TRADD的缺失對TAK1 / P38 MAPK信號傳導的影響機制，以及TRADD作為中樞銜接子，介導細胞死亡和炎癥信號[13-14]。盡管TRADD通常被認為是細胞質蛋白，但它也可能在細胞核中起作用[13]。TRADD還被證明是各種心臟損傷的重要保護因素，包括內質網（ER）應激，缺血再灌注（I/R）損傷[15-16]。在軟體動物中，細胞凋亡構成一種重要免疫反應，可以通過各種刺激引發，包括細胞因子，激素，毒性損傷，寄生蟲或病原體[17-19]。但目前為止，純粹的基因在軟體類研究未見報道，這也為馬氏珠母貝TRADD的研究增加了很大難度。本實驗通過RACE技術獲得馬氏珠母貝基因的cDNA序列全長并進行了生物信息學分析，qRT-PCR技術研究其在馬氏珠母貝6個組織中的表達情況，為進一步了解在馬氏珠母貝中的免疫學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

養殖于廣東省湛江市徐聞縣的2齡馬氏珠母貝為實驗用貝。取馬氏珠母貝閉殼肌、鰓、外套膜、肝胰腺、性腺和血淋巴6個組織作為本次實驗材料，凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 試劑

PrimeSTAR?Max?DNA?Polymerase、rTaq DNA聚合酶、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）、反轉錄試劑盒、DNA Marker、Amp、克隆載體pMD-18T等購自TAKARA公司，DEPC購自生工生物工程(上海)股份有限公司，RACE試劑盒購自Clontech公司；Trizol和SYBR?Select Master Mix購自賽默飛世爾科技公司，Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞購自全式金公司。

1.3 方法

1.3.1 cDNA的合成

1.3.1.1 mRNA的提取 運用Trizol法提取馬氏珠母貝閉殼肌等6個組織的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證其完整性，Nano Drop ND1000紫外分光光度計測各組織RNA濃度并分析純度。5′RACE和3′RACE模板的制備參照SMARTRACE cDNA Amplification Kit（Clontech公司）的說明書，實時熒光定量cDNA模板則參照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）說明書操作合成。

1.3.1.2 cDNA全長序列的獲得 從本實驗室構建的馬氏珠母貝血細胞轉錄組文庫中獲得注釋為TRADD的unigene序列[20]，并設計特異性引物（表1）。采用巢式PCR擴增法進行5和3末端的RACE擴增，獲得5和3末端序列，多聚酶鏈式反應擴增進行中間片段驗證。先通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，后根據純化回收試劑盒說明書純化目的基因片段；回收目的基因片段導入到pMD-18T載體中，再轉化到Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞中，挑取陽性單克隆菌落進行菌落PCR檢測，目的菌送生工生物工程(上海)股份有限公司分部廣州測序部測序。

表1 PmTRADD基因克隆及熒光定量所用的引物序列

1.3.2 生物信息學分析 使用DNAMAN軟件對已知的unigene序列和測序序列進行重疊拼接，獲得基因的cDNA全長序列。使用NCBI數據庫的ORF Finder （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）軟件預測該基因的開放閱讀框（ORF）并推導其氨基酸序列。使用Ex PASy-Prot Scale（http://web. expasy. org/protscale/）預測其疏水性，用Motif Scan（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）搜索檢測序列功能位點，采用Signal P 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/）預測其信號肽，通過Ex PASy-Prot Param（http://web. expasy. org/prot-scale/）分析其理化性質，SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi? NORMAL=1）預測其結構域。采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auto-mat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）在線網站預測二級結構，通過Clustalw在線軟件進行多序列比對；使用Mega 6軟件構建生物系統進化樹。

1.3.3 熒光定量檢測組織差異表達 通過實時熒光定量PCR檢測基因在馬氏珠母貝閉殼肌、鰓、外套膜、肝胰腺、性腺、血淋巴6個組織中表達情況，作為內參，每組樣品進行3次技術重復，每個組織進行4次生物學重復。各組織相對表達量用2-△△CT法計算。運用SPSS 18.0對實驗數據進行單因素方差分析，并用Duncan’s多重比較對均值進行差異顯著性檢驗，顯著性水平= 0.05。

2 結果分析

2.1 PmTRADD基因的cDNA克隆和序列分析

運用RACE技術擴增獲得基因cDNA全長為836 bp，其中5UTR為101 bp， 3UTR為144 bp，包含20 bp的poly A尾巴（圖1），ORF為591 bp，編碼196個氨基酸，預測其分子量約為21.89 ku理論等電點為8.42。

2.2 PmTRADD蛋白理化性質分析

PmTRADD蛋白的脂溶性系數（Aliphatic index）為54.29，不穩定指數為63.04，屬于不穩定蛋白?？偲骄H水性（Grand average of hydropathicity）為-0.721，屬于親水性蛋白（圖2），其中在第125位氨基酸達到最高親水性，親水指數為-2.322，在第180位氨基酸達到最高疏水性，疏水指數為1.556。PmTRADD不存在信號肽與跨膜結構域，表明該蛋白可能為非分泌蛋白。對PmTRADD序列進行功能位點檢測可知，該蛋白有2個N-糖基化位點，1個酰胺化位點，7個蛋白激酶C磷酸化位點，6個酪蛋白激酶II磷酸化位點，1個N-肉豆蔻?；稽c，3個微體C端靶向信號。二級結構預測結果顯示，該蛋白中α螺旋占41.84%，β轉角占3.06%，無規卷曲占45.41%，延伸鏈占9.69%。同時進行結構域預測分析，結果顯示PmTRADD氨基酸序列在第99~196位有一個DEATH結構域(圖3)。最后預測馬氏珠母貝PmTRADD蛋白分子的三維結構（圖4)。

起始密碼子ATG和終止密碼子TAA用方框標注; 陰影部分為DEATH結構域

The initial codon ATG and the termination codon TAA are marked with the box; Shades of gray showed DEATH domain

圖1基因的核酸序列及編碼的氨基酸序列

Fig. 1 The nucleotide and amino acids sequences ofgene from

圖2 PmTRADD蛋白疏水性

圖3 SMART 軟件預測的PmTRADD蛋白質結構

N: N末端; C: C末端(A: N-terminal; C: C-terminal)

2.3 多序列比對與進化樹建立

運用NCBI在線Blastx比對，結果顯示PmTRADD氨基酸序列與其它物種的相似性都較低。運用CLUSTALW軟件將PmTRADD的死亡域（DD）氨基酸序列與智利鼠(, XP_004628516.1)、佛羅里達海牛(, XP_004387623.1)、海獺(, XP_022373460.1)、劍魚(, XP_023191591.1)、九帶犰狳(, XP_012376990.1)和文昌魚(, AEO79023.1)的TRADD死亡域（DD）氨基酸序列進行多序列比對，結果表明物種間TRADD的同源性不高，其中與文昌魚的同源性最高，同源性值為37.04%，與劍魚的同源性最低，同源性值為29.90%（圖5）。運用MEGA 6軟件的Neighbor-Joining法構建馬氏珠母貝氨基酸序列與原牛（, NP_001039361.1）、小鼠（, NP_001028333.1）、人類（, NP_001310481.1）、佛羅里達海牛(XP_004387623.1)、海獺(XP_022373460.1)、珍珠雞（, XP_021269726.1）、虹鱒魚（, NP_001118111.1）、北極紅點鮭（, XP_023858136.1）和銀鮭（, XP_020334958.1）的TRADD氨基酸序列的系統進化樹，顯示人類、原牛和小鼠這3類哺乳動物聚為一簇，虹鱒魚、北極紅點鮭和銀鮭聚為一簇，并與哺乳類聚為一大支；佛羅里達海牛和海獺聚為一簇；而馬氏珠母貝單獨為一支，但是相對更靠近哺乳類。結果與傳統分類相吻合（圖6）。

“*”表示保守的氨基酸;“:”表示強相似的氨基酸;“.”表示弱相似的氨基酸

“*”indicate the conserved amino aicd;“:”indicate strong similar amino acid;“.”indicate weak similar amino acid

圖5 PmTRADD的死亡結構域氨基酸序列多序列比對

Fig. 5 Multi-alignment of the DEATH domain of PmTRADD amino acid sequence

圖6 馬氏珠母貝TRADD蛋白質序列聚類分析(Neighbor-Joining法)

2.4 PmTRADD組織差異表達分析

實時熒光定量PCR檢測在馬氏珠母貝閉殼肌等6個組織中的表達情況，2-△△CT法計算相對表達量。發現基因在各組織中均有表達，其中鰓組織表達量最高，其次是肝胰腺，在閉殼肌中基本不表達（圖7）。

A:閉殼肌; Gi:鰓; M:外套膜; He:肝胰腺; GO:性腺; B:血細胞;

相同小寫字母表示差異不具統計學意義（> 0.05）

A: Adductor muscle; Gi: Gill; M: Mantle; He: Hepatopancreas; Go: Gonads; B: Hemocytes;Same lowercase letters indicate no statistically significant difference (> 0.05)

圖7組織表達分布

Fig. 7expression distribution in different tissues

3 討論

基因編碼的蛋白質在C端存在一個死亡結構域。含有這種結構域的基因參與多種死亡受體誘導的細胞凋亡信號轉導通路，在細胞正常凋亡中起重要作用。當機體發出凋亡信號或其它刺激時，TRADD被腫瘤壞死因子招募并結合，參與細胞凋亡。TRADD的過度表達導致2種主要TNF誘導的反應，細胞凋亡和NF-κB的激活，它們分別依賴于其與FADD 和TRAF2的特異性相互作用[21]。本實驗利用RACE技術成功克隆出基因cDNA全長。經生物信息學分析發現PmTRADD無信號肽和跨膜結構域，說明該蛋白可能為胞內蛋白；二級結構預測中發現TRADD主要以α螺旋和無規則卷曲為主，三級結構中也發現其含有5個α螺旋和1個無規則卷曲，由此可推測兩親性的α螺旋在TRADD蛋白的信號傳導和募集其它效應分子的過程中扮演著主要功能。對其結構域預測發現，該蛋白第99~196位氨基酸形成特征性死亡結構域。對死亡結構域部分進行多序列比對，結果表明物種間TRADD保守性較低，與其它6物種間的一致性為32.80%，其中與文昌魚相似性最高，為37.04%。系統進化樹結果顯示馬氏珠母貝單獨聚為一支，與其它物種相離較遠。軟體動物中，基因的研究未見報道，但與其同源類基因相比較，在結構上均含有DEATH結構域，并且大多數DEATH結構域都由100個左右氨基酸形成，例如在香港牡蠣()中克隆分析的4種腫瘤壞死因子死亡受體基因都含有這些特征[22]。本研究從基因角度探究貝類TRADD蛋白在進化上是相對一致性，發現從軟體動物到高等脊椎動物，TRADD蛋白發生較大變異性。

為進一步探討功能，檢測在馬氏珠母貝不同組織中表達量情況，發現其在所檢測組織中均有不同程度表達，在閉殼肌中基本無表達，在鰓中表達量最高，其次是肝胰腺。雖然在軟體動物中未見TRADD更多報道，但在太平洋牡蠣()中發現的與TRADD緊密相關的TRAF2在鰓和肝胰腺中都有很高表達[23]；TRAF2作為TRADD蛋白的主要招募對象之一[4]，兩者在鰓和肝胰腺中共同的高表達現象，可猜測在細胞凋亡和其它免疫反應中，TRADD能迅速招募TRAF2，并完成機能反應。鰓與肝胰腺被認為是貝類參與宿主對病原體的免疫防御反應的主要免疫器官, 是機體受外界刺激，炎癥反應和損傷后修復等的主要參與者[24-25]。在馬氏珠母貝鰓和肝胰腺中的高表達，說明其可能在馬氏珠母貝細胞凋亡等免疫防御反應中擔任著重要角色。本研究以馬氏珠母貝中基因為研究對象，通過對其序列、理化性質、結構及表達進行研究，為進一步研究其在馬氏珠母貝免疫防御中的功能奠定基礎。

[1] 陸曉娟, 楊帥, 羅少杰,等. 馬氏珠母貝前列腺素E合酶2基因的克隆與表達分析[J]. 基因組學與應用生物學,2019, 39(4):1-14.

[2] 吳羽媛, 郭志穎, 梁海鷹, 等. 馬氏珠母貝基因的克隆與表達分析[J]. 廣東海洋大學學報, 2017, 37(4):1-7.

[3] KIM J Y, LEE J Y, KIM D G, et al. TRADD is critical for resistance to TRAIL-induced cell death through NF-κB activation[J]. FEBS Letters, 2011, 585(14): 2144-2150.

[4] HSU H, SHU H B, PAN M G, et al. TRADD-TRAF2 and TRADD-FADD interactions define two distinct TNF receptor 1 signal transduction pathways[J]. Cell,1996, 84(2):299-308.

[5] HSU H, XIONG J, GOEDDEL D V. The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell death and NF-κB activation[J]. Cell,1995,81(4): 495.

[6] ASHKENAZI, A. Death receptors: signaling and modulation[J]. Science,1998,281(5381): 1305-0308.

[7] POBEZINSKAYA Y L, KIM Y S, CHOKSI S, et al. The function of TRADD in signaling through tumor necrosis factor receptor 1 and TRIF-dependent Toll-like receptors[J]. Nature Immunology, 2008,9(9):1047-1054.

[8] CHEN, G. TNF-R1 signaling: a beautiful pathway[J]. Science, 2002, 296(5573): 1634-1635.

[9] MICHEAU O, JüRG TSCHOPP. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes[J]. Cell, 2003, 114(2): 181-190.

[10] WAJANT H, PFIZENMAIER K, SCHEURICH P. Tumor necrosis factor signaling[J]. Cell Death & Differentiation, 2003,10(1): 45-65.

[11] SWARUP V, GHOSH J, DAS S, et al. Tumor necrosis factor receptor-associated death domain mediated neuronal death contributes to the glial activation and subsequent neuroinflammation in Japanese encephalitis[J]. Neurochemistry International, 2008, 52(7): 1310-1321.

[12] SWARUP V, DAS S, GHOSH S, et al. Tumor necrosis factor receptor-1-induced neuronal death by TRADD contributes to the pathogenesis of Japanese encephalitis[J]. Journal of Neurochemistry, 2007, 103(2): 771-783.

[13] CHIO I I C, SASAKI M, GHAZARIAN D, et al. TRADD contributes to tumour suppression by regulating ULF-dependent p19Arf ubiquitylation[J]. Nature Cell Biology, 2012, 14(6): 625-633.

[14] XIE P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases[J]. Journal of Molecular Signaling, 2013, 8(1): 7.

[15] WANG F, WENG H, QUON M J, et al. FADD dominant negative dissipates the proapoptotic signalosome of the unfolded protein response in diabetic embryopathy[J]. American Journal of Physiology - Endocrinology And Metabolism, 2015, 309(10): 861-873.

[16] KRENZ M. Cell biology of ischemia/reperfusion injury[J]. International Review of Cell & Molecular Biology, 2012, 298: 229.

[17] KAZUTAKA T, TAKAHASHI K G. Mechanisms and immunological roles of apoptosis in molluscs[J]. Current Pharmaceutical Design, 2008, 14(2): 131-137.

[18]SOKOLOVA I M. Apoptosis in molluscan immune defense[J]. Invertebrate Survival Journal, 2009, 6(1): 49-58.

[19] ROMERO A, NOVOA B, FIGUERAS A. The complexity of apoptotic cell death in mollusks: An update[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2015, 46(1): 79-87.

[20] WANG W, WU Y, LEI Q. Deep transcriptome profiling sheds light on key players in nucleus implantation induced immune response in the pearl oyster[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2017, 118(2): 489-495.

[21]MARIE-CéCILE MICHALLET, MEYLAN E, ERMOLAEVA M A, et al. TRADD protein is an essential component of the RIG-like helicase antiviral pathway[J]. Immunity, 2008, 28(5): 651-661.

[22] XIANG Z , XIAO S , WANG F , et al. Cloning, characterization and comparative analysis of four death receptorTNFRs from the oyster[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2016, 59: 288-297.

[23] QU F, XIANG Z, ZHOU Y, et al. A molluscan TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) was involved in host defense against immune challenges[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2017, 71: 105-115.

[24] 吳羽媛，梁海鷹，阮堯，等. 馬氏珠母貝基因的克隆與組織表達分析[J]. 基因組學與應用生物學, 2018, 37(1): 238-246.

[25] 雷超，貝偉烈，鄭哲, 等. 馬氏珠母貝B型清道夫受體基因克隆與表達性分析[J]. 廣東海洋大學學報, 2017, 37(1): 7-14.

Gene Cloning and Tissue Expression Analysis offrom

HE Jun-jun, LIANG Hai-ying, CHEN Song, FANG Xiao-chen, HUANG Xue-min

（,,524088,）

【Objective】To clone the tumor necrosis factor receptor associated death domain protein (TRADD) gene and analyze its expression patterns in tissues of.【Method】The full-length cDNA sequence ofwas cloned by rapid amplification of cDNA ends (RACE) and the expression of this gene was analyzed by RT-PCR.【Result and Conclusion】Thefull-length cDNA contained 5′ UTR (101 bp) , the 3′ UTR (144 bp) and open reading frame (591 bp) which encoded 196 amino acids. Analysis of deduced amino acids showed that it has no signal peptide and transmembrane domain, and the C-terminus contains a death domain (DEATH). Results from multi-sequence comparisons showed that the DEATH domain of PmTRADD has low homology compared with other species.gene was with higher expression level in the gill, followed by the hepatopancreas, and almost no expression in the adductor muscle.

;; Gene cloning; Real-time PCR

Q78；Q959.215

A

1673-9159（2019）04-0013-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.003

2019-04-12

國家自然科學基金（31472306）; 廣東省海港建設與漁業產業發展專項（A201608B15）

何軍軍（1993－），男，碩士研究生，主要從事水產無脊椎動物增養殖和珍珠培育方向的研究。Email: 304458416@qq.com

梁海鷹（1971－），博士，教授。Email: zjlianghy@126.com

何軍軍，梁海鷹，陳崧，等. 馬氏珠母貝基因克隆與組織表達分析[J].廣東海洋大學學報，2019，39（4）：13-19.

（責任編輯：劉嶺）