尼羅羅非魚Galectin-3基因的原核表達(dá)與條件優(yōu)化

羅國玲，牛金中，黃 瑜，湯菊芬，蔡雙虎，簡紀(jì)常

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尼羅羅非魚Galectin-3基因的原核表達(dá)與條件優(yōu)化

羅國玲，牛金中，黃 瑜，湯菊芬，蔡雙虎，簡紀(jì)常

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 / 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

【目的】對(duì)Galectin-3蛋白進(jìn)行純化，優(yōu)化誘導(dǎo)相關(guān)表達(dá)條件，為大量獲取羅非魚Galectin-3蛋白提供方案。【方法】根據(jù)NCBI上已公布的羅非魚（）Galectin-3基因序列，設(shè)計(jì)多對(duì)帶RI和l酶切位點(diǎn)的引物，篩選出良性擴(kuò)增引物，對(duì)羅非魚cDNA經(jīng)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增、限制性快切酶雙酶切、T4連接酶連接等步驟，構(gòu)建羅非魚Galectin-3基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-Galectin-3，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，進(jìn)行Galectin-3重組蛋白的表達(dá)。并比較不同的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度條件下的表達(dá)效果，對(duì)Galectin-3蛋白表達(dá)最優(yōu)條件進(jìn)行篩選。【結(jié)果】構(gòu)建了羅非魚Galectin-3原核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行Galectin-3重組蛋白后發(fā)現(xiàn)37 ℃下，0.4 mmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)5 h即可誘導(dǎo)Galectin-3重組蛋白高效表達(dá)。免疫印跡結(jié)果顯示，經(jīng)蛋白純化柱純化后的pGEX-4T-Galectin-3重組蛋白可與GST-Tag單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)而表明表達(dá)的重組蛋白是羅非魚的Galectin-3蛋白。【結(jié)論】本研究成功構(gòu)建了羅非魚Galectin-3基因的原核表達(dá)載體，并確定了Galectin-3融合蛋白最適的表達(dá)條件：37 ℃下，0.4 mmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)5 h。

尼羅羅非魚；半乳糖凝集素-3；原核表達(dá)；條件優(yōu)化

凝集素（Lectin）是脊椎動(dòng)物中具有多種功能的原始分子。在免疫功能方面，凝集素通常能直接參與抵御病原侵入機(jī)體、參與免疫調(diào)節(jié)或炎癥反應(yīng)，通過與各種感染性物質(zhì)的表面結(jié)合后，進(jìn)行凝集細(xì)胞，沉淀多糖和復(fù)合碳水化合物等作用[1-2]。半乳糖凝集素（Galactin，S型動(dòng)物凝集素）是一種多價(jià)蛋白質(zhì)，具有識(shí)別和結(jié)合多種碳水化合物結(jié)構(gòu)的能力。這些蛋白質(zhì)至少有一個(gè)保守的糖識(shí)別區(qū)域（Carbohydrate Recognition Domain，CRD），其中約有130個(gè)氨基酸，并依據(jù)CDR的識(shí)別分為3類：原型、嵌合體型、銜接重復(fù)型。目前，已分離并確定了16個(gè)Galactins家族的成員，半乳糖凝集素是一種嵌合體型半乳糖凝集素。

尼羅羅非魚（）是我國南方最重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類[4]，然而，近幾年來無乳鏈球菌病對(duì)羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失，嚴(yán)重影響了羅非魚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[5]，因此對(duì)羅非魚的防御機(jī)制的深入研究非常迫切。已有研究表明，Galectin-3可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的生長和凋亡[6]，且在巨噬細(xì)胞活化過程中發(fā)揮重要作用[7]。目前，魚類半乳糖凝集素在魚類免疫系統(tǒng)中的研究尚處于起步階段，對(duì)其凝集素家族的研究已獲得半乳糖凝集素3的基因全長，對(duì)其轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平進(jìn)行了研究[2]，但還未見其蛋白水平的相關(guān)研究報(bào)道。

目前大腸桿菌表達(dá)體系已廣泛應(yīng)用于各種外源基因的表達(dá)，但并非每一種基因都能在其體內(nèi)表達(dá)，且基因的表達(dá)受宿主菌種類，菌體培養(yǎng)溫度，誘導(dǎo)時(shí)細(xì)菌生長密度及誘導(dǎo)劑種類、濃度和誘導(dǎo)時(shí)間[9]等多種因素影響，表達(dá)效率差異很大[8]。因此，本研究通過構(gòu)建Galectin-3基因的原核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入到大腸桿菌原核表達(dá)體系中，進(jìn)行Galectin-3重組蛋白的表達(dá)，并選取了可提高目標(biāo)蛋白活性和可溶性的BL21大腸桿菌作為宿主菌[10]及與乳糖相比，誘導(dǎo)效率更高的異丙基硫代半乳糖（IPTG）誘導(dǎo)劑[11]，對(duì)誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)Galectin-3蛋白進(jìn)行純化，為大量獲取羅非魚Galectin-3蛋白提供方案，以期為后續(xù)制備單克隆抗體及進(jìn)一步研究魚類凝集素功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用羅非魚購于廣東省湛江市湖光鎮(zhèn)周邊養(yǎng)殖場(chǎng)；pMD18-T克隆載體、DL2000DNA分子標(biāo)準(zhǔn)購自TaKara公司，RNA提取試劑盒、切膠回收試劑盒、蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)及DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞購自TRANS公司；質(zhì)粒提取試劑盒由Thermo scientific公司提供；原核表達(dá)載體pGEX- 4T（+）Vector由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚Galectin-3基因片段的擴(kuò)增 于無菌操作臺(tái)上摘取羅非魚的脾臟組織，液氮研磨法研磨組織，于無RNA酶操作環(huán)境下依照RNA提取說明書進(jìn)行羅非魚RNA的提取。瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量符合要求（條帶單一）后，按照反轉(zhuǎn)錄RT-PCR說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI上公布的羅非魚Galectin-3的基因序列（基因號(hào)：NC_031980.2）進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)引物GF：CCGGAATTCGACCTCTCAGACGCTC，GR:CCGC TCGAGGGGCATCATCTCCAT。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：rTaq Mix：10 μL、ddH2O：7 μL、引物（GF/GR）：1.0 μL、cDNA：1 μL，離心混勻后，實(shí)施PCR。PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性：95 ℃ 5 min；變性：95 ℃ 30 s；退火：55 ℃ 30 s；延伸：55 ℃ 45 s；36個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后終延伸：72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，依照PCR產(chǎn)物切膠回收試劑盒說明書進(jìn)行DNA的切膠回收得到純化的PCR產(chǎn)物。純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體在16 ℃條件下連接12 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板接種到帶氨芐抗性的瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 12 h后，使用載體上的通用引物M13-RV：GAG CGG ATC ACA ATT TCA CAC AGG和M13-47（-）：CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC，進(jìn)行菌落PCR鑒定，選取陽性克隆菌液送至上海生工測(cè)序部測(cè)序。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 對(duì)測(cè)序比對(duì)結(jié)果正確的pMD-18-Galectin-3重組質(zhì)粒及pEGX-4T空質(zhì)粒根據(jù)GeneJET Plasmid Miniprep Kit說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取。將重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶R1和I 分別進(jìn)行雙酶切操作，在37 ℃條件下酶切2 h，同樣使用瓊脂凝膠電泳法對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物純化處理。純化后的酶切產(chǎn)物在25~30 ℃下使用T4連接酶連接12 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素抗性的瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行涂板篩選，挑選合適的單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，陽性樣品克隆送至上海生工測(cè)序部測(cè)序。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 經(jīng)DNAMAN序列比對(duì)后鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-Galectin-3。按照1∶100的比例，接種鑒定正確的菌株及pGEX-4T空質(zhì)粒的菌株到含抗氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，在37 ℃震蕩條件下培養(yǎng)至菌液（600 nm）值在0.4~0.6[8]范圍內(nèi)，而后加入1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷IPTG進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。5 h后收集菌液，提取蛋白后進(jìn)行聚丙烯酰氨SDS-PAGE凝膠電泳分析。

1.2.4 重組蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化

1.2.4.1 IPTG濃度優(yōu)化：設(shè)置IPTG濃度梯度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，分別于37 ℃培養(yǎng)5 h后，12 000離心獲取菌液沉淀，使用高溫滅菌的PBS緩沖液洗滌3次，加入50 μL的PBS懸浮液與10 μL蛋白緩沖液染色，吹勻后100 ℃煮沸5 min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4.2 溫度優(yōu)化：IPTG濃度為1 mmol/L，分別在20 ℃和37 ℃恒溫條件下誘導(dǎo)4 h，收集菌液后按照上述步驟進(jìn)行誘導(dǎo)蛋白處理，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4.3 時(shí)間優(yōu)化：在最適的IPTG濃度和溫度下分別在震蕩培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 h時(shí)收集菌液，而后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4.4 重組蛋白表達(dá)形式分析：將在最佳表達(dá)條件下誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，進(jìn)行冰上超聲波破碎，離心后分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，使用未破碎的全菌做對(duì)照，確定重組蛋白的表達(dá)形式。

1.2.5 Western blot 分析 純化后的Galectin-3蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，400 mA條件下轉(zhuǎn)印45 min。將蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4 ℃條件下使用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的TBST（TBS-Tween-20）封閉2 h，封閉完成后使用TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；以鼠抗GST標(biāo)簽抗體做為一抗對(duì)目的蛋白進(jìn)行在室溫條件下孵育2 h，同樣TBST緩沖液洗滌3次；以HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗，與目的蛋白在室溫條件下結(jié)合1 h，TBST洗滌3次，使用DAB顯色試劑盒（碧云天生物技術(shù)）顯色。

2 結(jié)果分析

2.1 Galtin-3基因片段的擴(kuò)增以及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以羅非魚脾臟組織的cDNA為模板，用帶酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增，結(jié)果如圖1 A所示，片段長度約為690 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。使用pMD-18-T載體上的通用引物M13-47（-）和M13-RV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物片段大小約為850 bp（圖1 B），與預(yù)期結(jié)果一致，表明挑選的菌落為陽性克隆。經(jīng)NCBI上的序列比對(duì)軟件Blastx比對(duì)顯示，測(cè)序結(jié)果與目的序列100%相符，說明Galactic-3基因載體構(gòu)建成功。

2.2 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)

重組蛋白pGEX-4T-Galectin-3及其空載pGEX-4T菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的蛋白分子質(zhì)量約為51 ku和26 ku，與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，說明Galectin-3基因片段已連入pEGX-4T載體并表達(dá)Galectin-3融合蛋白。

M：DL2000 DNA凝膠電泳參照物；1：Galectin-3引物GF和GR擴(kuò)增DNA；2、3：引物M13-47(-)和M13-RV擴(kuò)增產(chǎn)物

M: DL2000 DNA Molecular Weight Standard; 1: DNA products by Galectin-3 specific primer GF and GR; 2, 3: Primers M13-47(-) and M13-RV amplification products

圖1 Galectin-3的克隆（A）及鑒定（B）

Fig. 1 Cloning (A) and identification (B) of galectin-3

M: TRANS蛋白SDS-PAGE電泳參照物；1、2：pGEX-4T誘導(dǎo)前后的全菌蛋白；3、4：pGEX-4T-Galectin-3誘導(dǎo)前后的細(xì)菌裂解物

M: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1: Empty vector without IPTG inducing; 2: Empty vector with IPTG inducing; 3: Recombinant bacteria without IPTG inducing; 4: Recombinant bacteria with IPTG inducing

圖2 融合蛋白pGEX-4T-Galectin-3的原核表達(dá)

Fig. 2 Prokaryotic expression of recombinant protein pGEX-4T-Galectin-3

2.3 大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的條件優(yōu)化

經(jīng)系列的SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳結(jié)果顯示，當(dāng)IPTG為0.4 mmol/L濃度時(shí)，重組蛋白表達(dá)量達(dá)到最大（圖3）。誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)，誘導(dǎo)效果最佳（圖4）。誘導(dǎo)時(shí)間為5 h的時(shí)候，重組蛋白表達(dá)量已經(jīng)達(dá)到最大值（圖5）。

M：TRANS蛋白SDS-PAGE電泳參照物；1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的Galectin-3細(xì)菌裂解液；2-6：IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的細(xì)菌裂解液

M: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1: Galectin 3 bacterial lysate not induced by IPTG; 2-6: IPTG induced bacterial lysates at concentrations of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L

圖3 不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)pGEX-4T-Galectin-3表達(dá)影響

Fig. 3 Effect of different IPTG concentrations on the expression of pGEX-4T-Galectin-3

M1：TRANS蛋白SDS-PAGE電泳參照物； 1、2：37 ℃條件下誘導(dǎo)前后的Galectin-3全菌蛋白；3、4: 20 ℃條件下誘導(dǎo)前后的Galectin-3全菌蛋白

M1: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1, 2: Galectin-3 whole bacterial protein before and after induction at 37 ℃; 3, 4: Galectin-3 whole bacterial protein before and after induction at 20 ℃

圖4 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)Galectin-3表達(dá)的影響

Fig. 4 Expression of protein pGEX-4T-Galectin-3 at different temperature

2.4 Galactic-3重組蛋白可溶性分析

在最佳的誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.4 mmol/L在37 ℃下誘導(dǎo)5 h）將pGEX-4T-Galectin-3重組質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)至50 mL，在超聲波破碎處理后，取含有重組蛋白的細(xì)菌裂解液的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果表明，可溶性蛋白為目的蛋白的主要表達(dá)形式，包涵體蛋白表達(dá)相對(duì)于可溶性蛋白少（圖6）。

M：TRANS蛋白SDS-PAGE電泳參照物；1：誘導(dǎo)的全菌蛋白；2-7：IPTG誘導(dǎo)時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h后的Galectin-3的重組蛋白裂解液

M: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1, whole induced bacterial protein; 2-7: Total protein of recombinant bacteria inducing at 1, 2, 3, 4, 5, 6 h, respectively

圖5 不同時(shí)間對(duì)Galectin-3表達(dá)的影響

Fig. 5 Protein expression of pGEX-4T-Galectin-3 in different inducing time

M：TRANS蛋白SDS-PAGE電泳參照物；1、2：在最適條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的Galectin-3重組蛋白的裂解液上清和沉淀；

M: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1, 2: The inclusion body protein and soluble protein induced at optimum induction condition

圖6 重組蛋白可溶性分析

Fig. 6 Solubility analysis of pGEX-4T-Galactic-3 protein

2.5 重組蛋白的純化及鑒定

在最優(yōu)條件下，即pGEX-4T-G、alactic-3重組蛋白在37 ℃條件下以0.4 mmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)5 h進(jìn)行蛋白表達(dá)，經(jīng)蛋白純化柱純化、SDS-PAGE蛋白凝膠電泳結(jié)果可見，可溶性蛋白的為主要的目的蛋白形式表達(dá)，且純化后的蛋白條帶單一。Western-blot結(jié)果顯示，重組蛋白與GST-Tag單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明表達(dá)的重組蛋白為羅非魚的Galectin-3蛋白（圖7），表明羅非魚Galectin-3片段重組蛋白成功表達(dá)。

M：TRANS蛋白SDS-PAGE電泳參照物；1、4：未誘導(dǎo)的Galectin-3細(xì)菌裂解液； 2、5：誘導(dǎo)后的可溶性蛋白；3、6：純化后的pGEX-4T-Galactic-3重組可溶性蛋白

M: TRANS protein SDS-PAGE electrophoresis reference; 1 and 4: Total bacterial protein before induction of pGEX-4T-Galectin-3; 2 and 5: pGEX-4T-Galectin-3 Bacterial lysate supernatant after induction; 3 and 6: Purified pGEX-4T-Galectin-3

圖7 Galectin-3 聚丙烯酰氨凝膠電泳(1，2，3)以及 Western blotting 鑒定(4，5，6)

Fig. 7 Identification of Galectin-3 by SDS-PAGE (1, 2, 3) and Western blotting (4, 5, 6)

3 討論

Galactin屬于動(dòng)物凝集素，廣泛存在于哺乳動(dòng)物、鳥類、兩棲動(dòng)物、魚類、線蟲和真菌等生物體中，且具有高度保守性[12]。在生物學(xué)功能方面，半乳糖凝集素具有調(diào)理細(xì)胞增殖、調(diào)理細(xì)胞黏附及調(diào)理細(xì)胞凋亡等功能[13]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)無乳鏈球菌以及嗜水氣單胞菌感染后羅非魚Galectin-3的mRNA在腎臟、脾臟、鰓和皮膚組織中有較高的表達(dá)[2]，表明半乳糖凝集素-3可能在尼羅羅非魚的免疫應(yīng)答中起十分重要的作用。這可能是由于魚的皮膚和鰓在懸浮物的過濾中起著關(guān)鍵的作用，同時(shí)這也是對(duì)抗病原體的第一道屏障，并參與魚類的先天免疫和適應(yīng)性免疫[14-15]，脾臟、腎臟也是重要的魚類免疫器官[16-17]。然而目前對(duì)羅非魚Galectin-3在蛋白水平上的研究尚未見報(bào)道，本研究對(duì)羅非魚Galectin-3的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了克隆鑒定，并成功表達(dá)于大腸桿菌中從而獲得帶GST標(biāo)簽的融合蛋白。

本研究使用的表達(dá)菌株為大腸桿菌，而大腸桿菌表達(dá)體系是最先應(yīng)用于蛋白表達(dá)研究的，目前最成熟的表達(dá)體系。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的快速且高產(chǎn)量的細(xì)胞繁殖、能使用IPTG進(jìn)行簡易快速的誘導(dǎo)表達(dá)等特點(diǎn)，使其成為最常用的生產(chǎn)重組蛋白的表達(dá)體系[18]。本研究選用pGEX-4T-1表達(dá)載體，該載體優(yōu)點(diǎn)是自帶GST融合標(biāo)簽，在大腸桿菌中具一定的溶解度，減少包涵體的形成，對(duì)后續(xù)蛋白檢測(cè)、分離純化與鑒定及蛋白功能的研究提供便利[19-20]。重組蛋白可溶性分析結(jié)果顯示，Galectin-3蛋白主要以可溶性蛋白形式表達(dá)。在科研和生產(chǎn)應(yīng)用中，重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式主要有3種：胞外分泌、周質(zhì)空間表達(dá)及胞內(nèi)表達(dá)[21]，胞外分泌和周質(zhì)空間表達(dá)的蛋白為可溶性蛋白，而胞內(nèi)表達(dá)的蛋白是易無活性的包涵體蛋白。包涵體形成有利于防止蛋白酶對(duì)重組蛋白的降解，而且適宜表達(dá)一些毒蛋白如抗菌肽[22]，但是這些包涵體形式表達(dá)的蛋白通常是錯(cuò)誤折疊的，不具備生物活性[23]，這不便于蛋白的節(jié)后分析及蛋白組學(xué)的研究，所以大多數(shù)情況下都將不溶性的包涵體蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性的蛋白[24]。本研究中在最適條件下獲得的Galectin-3蛋白主要為可溶性蛋白，不需經(jīng)變性、復(fù)性等方法使蛋白重新折疊，即可實(shí)現(xiàn)Galectin-3蛋白的大量回收，為后續(xù)的單克隆抗體制備奠定了基礎(chǔ)。

在純化過程中，目的蛋白的大量表達(dá)與誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度及誘導(dǎo)的溫度有關(guān)[8]，筆者對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及IPTG（異丙基硫代半乳糖）濃度等表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)本研究中最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5 h，對(duì)比黃瑜對(duì)紅笛鯛基因融合蛋白[25]、潘濱對(duì)煙草曲莖病毒復(fù)制相關(guān)蛋白基因[26]、王秋霞對(duì)豬囊尾蚴排泄分泌抗原Ts881蛋白[27]及史繼靜對(duì)人基因在原核生物[28]等進(jìn)行原核表達(dá)條件優(yōu)化的最適誘導(dǎo)時(shí)間一般在2~6 h之間，本研究結(jié)果在適宜范圍內(nèi)，說明結(jié)果可信。本研究結(jié)果顯示5 h和6 h的蛋白表達(dá)量無顯著差異，說明超過一定時(shí)間，誘導(dǎo)時(shí)間的增加不能使目的蛋白持續(xù)表達(dá)；誘導(dǎo)劑IPTG濃度在0.4 mmol/L時(shí)蛋白表達(dá)量最大，超過此濃度，蛋白表達(dá)量不會(huì)隨IPTG濃度的增加而增大，說明IPTG對(duì)細(xì)菌生長有一定的抑制作用，與陸海等[10]研究結(jié)果一致；誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)，比20 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)的的目的蛋白量高，推測(cè)其原因可能是37 ℃時(shí)，與蛋白合成相關(guān)酶的活性最大，故催化合成的目的蛋白量最大。隨后的Western blot分析表明，未純化的全菌可溶性蛋白和純化的Galectin-3蛋白，均能較好地與GST單克隆抗體很好的結(jié)合，且條帶單一，進(jìn)一步證明了該重組蛋白為Galectin-3。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了羅非魚Galectin-3基因的原核表達(dá)載體，確定了最優(yōu)的融合蛋白表達(dá)條件為37 ℃下，0.4 mmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)5 h，并純化得到了Galectin-3蛋白。

[1] DIAS R D O, MACHADO L D S, LUDOVICO M, et al. Insights into animal and plant lectins with antimicrobial activities[J]. Molecules. 2015, 20(1): 519-541.

[2] ZHU J J, WEI M, WANG Q H, et al. Characterization and expression of galectin-3 afterandchallenge in GIFT strain Nile tilapia()[J]. Fish and Shellfish Immunology, 2019, 86: 974-980

[3] 夏焱. 家蠅蛹凝集素的分離純化及對(duì)鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響[D]. 天津: 天津科技大學(xué), 2012.

[4] ELSAYED A F M . Total replacement of fish meal with animal protein sources in Nile tilapia,(L), feeds[J]. Aquaculture Research, 1998, 29(4): 275-280.

[5] YIN X, MU L, BIAN X, et al. Expression and functional characterization of transferrin in Nile tilapia () in response to bacterial infection[J]. Fish Shellfish Immunol, 2018, 74: 530-539.

[6] YANG R Y, HSU D K, LIU F T. Expression of galectin-3 modulates T-cell growth and apoptosis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996, 93(13): 6737-6742.

[7] MACKINNON A, FARNWORTH S P, HENDERSON N, et al. Regulation of alternative macrophage activation by Galectin-3[J]. Journal of Immunology, 2008, 180(4): 2650-2658.

[8] 許崇利, 楊梅, 許崇波. 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的影響因素[J]. 中國動(dòng)物檢疫, 2010, 27(8): 66-68.

[9] 曹紅, 仇燕, 王剛. 外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 28(1): 82-85.

[10] 陸海, 吳薇, 曾慶銀, 等. 大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)重組蛋白的研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 23(6): 1-4.

[11] 吳一凡, 張雙全, 高秀玉, 等. 乳糖誘導(dǎo)pET載體表達(dá)重組蛋白的研究[J]. 南京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2002, 25(1): 89-93.

[12] 楊麗麗. 斑馬魚甘露糖結(jié)合凝集素基因的表達(dá)和免疫功能的研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2014.

[13] 盧曉，陳政良. 半乳糖凝集素[J]. 免疫學(xué)雜志, 2004, 20(s1): 21-23.

[14] PENNACCHI Y, LEEF M J, CROSBIE P B, et al. Evidence of immune and inflammatory processes in the gills of AGD-affected Atlantic salmon, Salmo salar L.[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2014, 36(2): 563-570.

[15] XU Z, PARRA D, G?MEZ D, et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2013, 110(32): 13097-13102.

[16] 陸志款. 復(fù)方中草藥對(duì)紅笛鯛生長及免疫功能的影響[J]. 當(dāng)代水產(chǎn), 2013(11): 74-75.

[17] HEDRICK R P, MACCONNELL E, KINKELIN P D. Proliferative kidney disease of salmonid fish[J]. Annual Review of Fish Diseases, 1993, 3(3): 277-290.

[18] 朱峰. 家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP26及其宿主互作蛋白的研究[D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇科技大學(xué), 2013.

[19] SHARROCKS A D. A T7 expression vector for producing N- and C-terminal fusion proteins with glutathione S-transferase[J]. Gene, 1994, 138(1/2): 105-108.

[20] 牛金中, 黃瑜, 湯菊芬, 等. 尼羅羅非魚補(bǔ)體3基因片段的原核表達(dá)及條件優(yōu)化[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 38(2): 80-84.

[21] 余波, 程安春, 汪銘書. 大腸桿菌中重組蛋白可溶性表達(dá)的研究進(jìn)展及展望[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2008, 50(10):19-21.

[22] VILLAVERDE A , M. MAR CARRIó. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies[J]. Biotechnology Letters, 2003, 25(17):1385-1395.

[23] MARSTON F A . The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in[J]. Biochemical Journal, 1986, 240(1):1-12.

[24] 蘇裕. 大腸桿菌中重組蛋白可溶性表達(dá)的研究[D]. 廣州: 華東師范大學(xué), 2007.

[25] 黃瑜，張雪利，魯義善，等. 紅笛鯛基因融合蛋白原核表達(dá)條件的優(yōu)化及純化[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 33(1): 44-49.

[26] 潘濱, 吳建祥, 李桂新, 等. 煙草曲莖病毒復(fù)制相關(guān)蛋白基因原核表達(dá)條件優(yōu)化[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2007, 51(1): 24-28.

[27] 王秋霞, 張美英, 張改平, 等. 豬囊尾蚴排泄分泌抗原Ts881蛋白原核表達(dá)條件的優(yōu)化[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2009, 24(3): 59-63.

[28] 史繼靜, 劉朝奇, 楊凡, 等. 人基因的克隆及其在原核生物中表達(dá)及條件的優(yōu)化[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2010, 58(5): 135-140.

Prokaryotic Expression and Condition Optimization of Galectin-3 Gene in

LUO Guo-ling，NIU Jin-zhong，HUANG Yu，TANG Ju-fen，CAI Shuang-hu，JIAN Ji-chang

（,524088,）

【Objective】The prokaryotic expression and expression conditions of galectin-3 gene were optimized to obtain a large amount of proteins, laying a foundation for further preparation of monoclonal antibodies.【Methods】Based on the published sequence of Galicon () Galectin-3 gene on NCBI, several pairs of primers withRI andl restriction sites were designed to screen for benign amplification primers, and the tilapia cDNA was polymerase-chained. The prokaryotic expression plasmid pGEX-4T-Galectin-3 of tilapia Galectin-3 gene was constructed by reaction (PCR) amplification, restriction enzyme digestion and T4 ligase ligation, and the recombinant plasmid was introduced intoBL21. In the expression of Galectin-3 recombinant protein, we compared the expression effects of different induction temperature, induction time and IPTG concentration, and screened the optimal conditions for Galectin-3 protein expression. 【Results】pGEX-4T-Galectin-3 was successfully constructed and the Galectin-3 recombinant protein was expressed. It was found that the high expression of Galectin-3 recombinant protein was induced by IPTG at a concentration of 0.4 mmol/L for 5 h at 37 ℃. Western blot results showed that the recombinant protein pGEX-4T-Galectin-3 purified by protein purification column could specifically react with GST-Tag monoclonal antibody, indicating that the expressed recombinant protein is Galectin-3 protein of tilapia. 【Conclusion】In this study, the prokaryotic expression vector of the tilapia Galectin-3 gene was successfully constructed, and the optimal expression conditions of the Galectin-3 fusion protein were determined. The highest concentration was obtained by inducing IPTG at a concentration of 0.4 mmol/L for 5 h at 37 ℃.

；Galectin-3；prokaryotic expression；condition optimization

S917.4

A

1673-9159（2019）04-0035-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.006

2019-04-28

國家自然科學(xué)基金（31572651）

羅國玲（1996－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害防治。E-mail：1433792702@qq.com

簡紀(jì)常，男，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害防治。E-mail：jianjc@gmail.com

羅國玲，牛金中，黃瑜，等. 尼羅羅非魚Galectin-3基因的原核表達(dá)與條件優(yōu)化[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（4）：35-41.

（責(zé)任編輯：劉朏）