核小球藻培養液的循環利用

符虹宇，李雁群,3，蔡奇珍，梁皓輝，黎釗坪，胡雪瓊

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核小球藻培養液的循環利用

符虹宇1,2，李雁群1,2,3，蔡奇珍1，梁皓輝1,2，黎釗坪1,2，胡雪瓊1,2

（1. 廣東海洋大學食品科技學院 / 2. 廣東海洋大學食品科技學院海洋藥物研究所 / 3. 廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【目的】探討蛋白核小球藻采收后培養液是否能循環再用于小球藻的培養。【方法】采用小球藻分批培養完成采收細胞后所得培養廢液來配制培養基，重新進入下一批次小球藻培養。以藻類BG11培養基配方為基準，按照配方全部或部分補充營養鹽，通過測定藻液的光密度值間接反映藻生物量，比較小球藻在循環培養中的生長情況。【結果】在連續循環利用回收水至第4批次培養收獲時培養液的光密度（600 nm）為9.9，比生長速率為0.80 d-1，與第1批培養收獲時培養液的光密度（600 nm）和比生長速率相比，小球藻細胞產量和生長速率均未受影響。經過4個輪次的循環培養，用水量可減少約75%。在連續循環培養中僅補充N、P、S鹽，至第3個循環小球藻收獲時的生物量變化在10%以內。【結論】在加糖混養、保持連續光照、按照BG11配方補全營養鹽的培養條件下，至少可對蛋白核小球藻進行4個周期的循環培養。按照BG11配方量補充相應的N、P、S鹽，減少其他營養鹽的投放，在2個循環周期內可以維持蛋白核小球藻的正常生長。利用培養廢液實現小球藻循環經濟培養和減少生產排放方法可行。

蛋白核小球藻、微藻培養、培養液循環

小球藻（sp.）是一種普生性單細胞淡水綠藻，其適應能力強，繁殖速率高，易于人工培養[1]。小球藻富含蛋白質、維生素、多不飽和脂肪酸、多糖、礦物質等，可作為膳食營養補充劑[2]。目前小球藻已被開發成如小球藻飲料、小球藻面食、小球藻營養片等各種健康食品[3]。有研究表明，小球藻具有良好的醫療保健作用，可幫助改善心血管疾病、高血糖癥、癌癥和提高免疫力[4]；還可生產高價值生物活性物質，在醫藥方面具有開發利用前景[5]；在固定二氧化碳，減少溫室氣體，生產生物質用于能源、飼料、化工原料等方面，小球藻也有很好的前景[6-8]。但是，目前小球藻的培養成本較高的問題未能有效解決，大規模人工培養的小球藻還主要局限應用于食品、營養品和藥品相關的高附加值產品領域。

微藻生產的成本構成主要有培養基營養鹽、培養過程的動力能源消耗、藻細胞采收過程的動力能源消耗、藻細胞干燥的能源消耗和藻培養過程的用水和水處理費用等。為降低微藻生產成本，目前已經對藻種選育、培養條件優化、貼壁培養技術等[9-10]不同生產環節開展了大量研究。生產用水雖然單價較低，甚至可以直接從自然水體中抽取，但水在輸送、預處理和排放水凈化處理等方面的費用卻必須投入，而且培養用水量越大成本越高。微藻的培養用水如果能夠在一定時間內循環利用，不進行排放和凈化，則可以有效簡化操作，節約資源和成本。但關于培養廢水是否可以直接再利用于微藻培養，以及如何循環利用等方面的研究報道鮮見。本研究以小球藻為對象，通過對培養蛋白核小球藻后的廢液進行循環利用，觀察循環水對蛋白核小球藻生物量生長的影響，探討循環培養的可能性以及措施，以期達到降低微藻生產成本，提高微藻生產經濟效益的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

蛋白核小球藻購自中國科學院淡水藻種庫，編號FACHB-5。

1.2 基礎培養基配方及培養條件

BG11培養基基礎配方中，N鹽：NaNO31.5 g/L；P鹽：K2HPO40.04 g/L；S鹽：MgSO4?7H2O 0.075 g/L；CaCl2?2H2O 0.036 g/L；Na2CO30.02 g/L；A4：C6H8O70.60 mg/L、（NH4）3Fe（C6H5O7）20.60 mg/L、Na2EDTA 0.10 mg/L；A5：H3BO32.86×10-3g/L、MnCl2?4H2O 1.81×10-3g/L、ZnSO4?7H2O 0.22×10-3g/L、Na2MoO4?2H2O 0.39×10-3g/L、CuSO4?5H2O 0.80×10-4g/L、Co(NO3)2?6H2O 0.49×10-4g/L。

用1 mol/L NaOH或HCl調整培養基的pH至6.5，然后將配制好的培養基分裝進250 mL錐形瓶，每瓶90 mL，經121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后加入10 mL 40 g/L無菌葡萄糖母液（經過115 ℃滅菌處理20 min）。搖床培養條件為（26 ± 1）℃，2 000 lx連續光照，150 r/min。

1.3 實驗設計

以加質量分數0.4%的葡萄糖混養的方法適當提高藻細胞密度，縮短每批次的培養時間。先通過測定小球藻在7 d培養期內的藻細胞密度，繪制生長曲線，尋找分批培養條件下生物量生長處于培養周期平臺期的時間，確定每批次培養的藻細胞收獲時間。

第1個循環培養（cycle 1）按照常規方法培養，用純凈水配制培養基，一定天數后離心收獲藻細胞并收集培養廢液用于制備第2個循環培養（cycle 2）培養基的配制用水。同理，第3（cycle 3）、四個（cycle 4）循環培養則各取前一個循環培養采收時離心得到的培養廢液來配制培養基。小球藻在循環水培養的探究中，不同循環間除培養基用水不同外，添加的營養鹽成分和含量均相同。

小球藻在補加不同營養鹽成分和含量的循環培養基中的生長狀況的探究中，同一循環不同營養鹽組間，添加的營養鹽成分和含量均不同。以BG11培養基配方為基礎，共劃分7個營養組，其分別為：全BG11、全NPS（按BG11配方，僅添加N、P、S鹽）、全N半PS（N鹽含量與BG11一致，P鹽和S鹽為BG11配方量的一半）、全N半PS + CaCl2?2H2O、全N半PS + Na2CO3、全N半PS + A4、全N半PS + A5。每組設置3個平行。以純凈水配制的常規培養基作為對照。

圖1 循環培養流程

1.4 藻細胞密度測定

液體培養中小球藻干重與培養液的吸光度成一定的線性關系，可通過測定光密度值間接代表小球藻的生物量[11]。將待測藻液用可見分光光度計[WFJ7200，尤尼柯（上海）儀器有限公司]測定其在600 nm處的光密度值（600 nm)，以每組未接種的培養基作為該組的空白對照。

1.5 數據處理

藻細胞在第天的比生長速率μ計算公式：

μ=（lnN–ln1）/（- 1），

式中，N是第天時小球藻的生物量，1是小球藻初始培養的生物量。

2 結果與分析

2.1 小球藻在正常培養條件下的生長曲線

在1.2節所述的BG11培養基中批式培養，小球藻的生長曲線如圖2所示。由圖2可以看出，接種1 d后，小球藻快速生長，培養2 d后的培養液的（600 nm）值是培養1 d后的指數倍數，說明此時處在小球藻對數生長期。培養至3 d，小球藻開始進入穩定期，3 ~ 7 d的光密度值基本保持不變。因此，以4 d為一個批次培養周期的培養時間，培養4 d后收獲藻細胞，培養時間不至于太長，生物量已經達到生長周期的平臺期，且較穩定。

圖2 蛋白核小球藻在混養條件下的生長曲線

2.2 小球藻在循環水培養基中的生長

利用培養廢液循環培養小球藻，其生長情況如圖3所示。第1個循環即利用純凈水配置的BG11培養基培養小球藻，第2、3、4循環即利用培養廢液培養小球藻。在接種后0 ~ 1 d，第2個循環中小球藻的生長速度較其他循環快，可能小球藻對培養廢液有短暫適應期。在培養1 ~ 2 d，各個循環中小球藻均迅速增長，但其生長曲線各不相同。培養3 d后，各個循環中小球藻的生長均趨于穩定。由于小球藻干重與培養液的吸光度成一定的線性關系，依據培養4 d后收獲時小球藻的光密度值，小球藻的生物量在第2個循環中是高于第1個循環，而在第3、4個循環中，其生物量較第2個循環是下降的，但與第1個循環比較無顯著差異。經過4個循環后，小球藻的生物量沒有表現出下降趨勢，說明通過利用培養廢液循環培養小球藻，減少水排放、降低總成本在一定程度上是可行的，并且可以繼續循環培養小球藻，進一步探究循環培養的極限。

圖3 蛋白核小球藻在循環水培養基中的生長

2.3 補充不同含量N、P、S營養鹽循環培養中小球藻生物量的變化

為了探討在循環培養中是否可以減少營養鹽的用量，以降低培養成本，本研究按1.2節所述在循環培養廢液中補充相應的N、P、S營養鹽，而不是添加完整營養鹽，觀察收獲時小球藻生物量的變化。從圖4可以看出，僅補充N、P、S營養鹽，小球藻收獲時的生物量從第3個循環開始下降，到第4個循環時，收獲時的生物量較用純凈水培養減少20%。循環培養中，在第2、3循環中僅補充N、P、S營養鹽，小球藻收獲時的生物量變化在10%以內，可考慮在第4個循環時補全配方中營養鹽，維持循環培養中小球藻的生物量。當在循環培養廢液中按1.2所述配方補全N鹽，而P、S鹽減半，其他營養鹽不補充時，從第2個循環培養開始，小球藻的生物量產量明顯下降（＜0.05），第2至4個循環的生物量分別只有正常培養條件下的54%、56%、56%。僅補充全N半PS在1個循環內是無法維持小球藻的正常生物量。僅補充全NPS營養鹽，隨著循環數的增加，收獲時小球藻的生物量隨之減少，且減少幅度逐漸增大。但僅補充全N半PS的循環培養中雖然生物量有所減少，但變化幅度不大。

2.4 全N半PS的循環培養液中補充其余營養鹽條件下小球藻生物量的變化

為了觀察在補全N營養鹽同時減少P、S營養鹽供給的情況下，單獨補充BG11配方中其他營養鹽組分是否能使小球藻生物量產量得到一定程度的恢復，根據1.3節所劃分的營養鹽組分，在循環培養廢液中補充相應的營養鹽。從圖5可以看出，單獨補充CaCl2?2H2O、Na2CO3、A4、A5這4個營養鹽組分，收獲時的小球藻生物量均無顯著提高（> 0.05）。

同一循環不同組之間相同字母表示差異不具統計學意義（> 0.05）

The same letter between different groups in the same cycle mean the difference between them has no statistical significance (> 0.05)

圖4 補充N、P、S鹽對循環培養下小球藻生物量的影響

Fig. 4 The effect of supplementing Nitrogen, Phosphorus and Sulfur salt on biomass ofin cycling culture

同一循環不同組之間相同字母表示差異不具統計學意義（> 0.05）

The same letter between different groups in the same cycle mean the difference between them has no statistical significance (> 0.05)

圖5 補充其余營養鹽對循環培養下小球藻生物量的影響

Fig. 5 The effect of supplementing other nutrients on the biomass ofin cycle culture

2.5 循環培養液中補充不同營養鹽組分條件下小球藻的比增長速率

利用培養基廢液，通過添加不同營養鹽組分，循環培養小球藻，其比增長速率如表1所示。從表中可以看出，在補加全BG11的條件下，4個循環內，小球藻的比增長率較對照無顯著差異（> 0.05）。補加全NPS鹽組，其第2循環比生長速率較全BG11組高，第3、4個循環較全BG11組低，但與對照無顯著性差異（> 0.05）。在循環培養液中減少其他營養鹽的投放，僅補加相應的N、P、S鹽，至少在4個循環內可維持小球藻增長速率。

在減少P、S鹽投放的條件下，補加CaCl2?2H2O、Na2CO3、A4、A5這4個營養鹽組分中的任意一組，小球藻的比增長速率在2個循環內較全N半PS組無顯著提高（< 0.05）。而在第4個循環時，任一補加CaCl2?2H2O、Na2CO3、A5這3個營養鹽組分中的一組，小球藻的比增長速率在較全N半PS鹽組有恢復現象，但不顯著（> 0.05）。補加A4營養鹽組分, 小球藻的比增長速率雖然較全N半PS鹽組有顯著提高，但仍顯著低于全NPS鹽組（＜0.05）。在補全N營養鹽同時減少P、S營養鹽供給的情況下，補加CaCl2?2H2O、Na2CO3、A4、A5這4種營養鹽組分中的任意一組，無法使小球藻的比增長速率得到較好的恢復。在循環培養中，可通過補加相應量的N、P、S鹽在一定程度上維持小球藻的比生長速率，其他營養鹽可在循環一定次數后再按配方補全，達到節約資源、簡化操作、延長循環培養時間的目的。

表1 添加不同營養鹽條件下小球藻連續循環培養的比增長速率

注：同一循環不同營養鹽組分組之間相同字母表示差異無統計學意義（> 0.05）。

Note: The same letter between different groups in the same cycle mean the difference between them has no statistical significance (> 0.05).

3 討論

微藻對于生產生物質用于能源、化工、飼料、食品、醫藥都有很好的前景，既可獲得生物原料又可改善生態環境的新型高效農業。但是，由于目前微藻生物質生產成本太高，微藻生產應用不夠廣泛[12]。為降低微藻生產的成本，前人針對微藻主要生產環節展開了研究，從育種[13-14]、培養[15-16]、采收[17-19]，到干燥、破碎、油脂提取等后加工[20-21]都有大量的研究報道。微藻培養應以節約用水為原則，但是水的獲取、預處理和培養廢水的后處理成本消耗很高。就小球藻培養而言，按照開放池培養的一般水平，微藻培養液的藻細胞質量濃度在0.5 ~ 2.0 g/L[22]，據估計每生產1 kg小球藻干物質需用1 t水[23]。微藻生產中95%以上的生產用水在收獲藻細胞以后被排放而廢棄，另外不足5%的生產用水留在藻泥中，在干燥過程中損失。如果利用小球藻生產生物柴油，每生產1 kg生物柴油的耗水量將達到3.726 t[24]。水的消耗因不同的藻種和微藻生產技術而不同，但是水量消耗巨大是共同的特點。

在微藻培養中培養液在回收藻細胞后形成的廢水是否可以再次用于微藻培養，需要考慮微藻的代謝產物是否會抑制藻細胞生長。本研究采用加糖混養的方式增大微藻細胞密度，以增加培養液中代謝物的濃度。結果顯示，在本研究條件下未出現代謝產物抑制現象。Monte等[25]采用膜過濾技術處理培養廢水實現杜氏鹽藻（）培養基的循環利用，Fret等[26]研究了在實驗室規模和中試規模的微擬球藻（sp.）培養基回用，Farooq等[27]研究了不同的藻細胞采收方式對普通小球藻（）培養液回用的影響，均發現培養廢水回用于微藻循環培養是可能的，筆者的研究結果與上述文獻一致。目前，有關培養水的循環利用的研究極其有限，用于循環培養的藻種有節旋藻（）[28]、杜氏鹽藻[25]、微擬球藻[26]和普通小球藻[27]等，但是未見蛋白核小球藻循環培養的研究報告。本研究用培養廢水替代純凈水，實現蛋白核小球藻循環培養，這對于在較低細胞密度的開放池培養蛋白核小球藻并回用培養水更具有可行性和重要的現實意義。

目前循環培養研究中[25-28]有關培養水的回用大多關注采收技術和培養基的補充對循環培養影響，僅做了一次循環培養試驗。循環水每回收利用一次，水的耗用量能減少一半，但水的消耗和廢水的排放量依然還是巨大的，故能夠實現的循環次數越多，排放水量就越少，水消耗量就越少。因此，如果能夠實現多次或者無限次循環，就能實現零排放循環培養。筆者通過4個循環的培養，發現小球藻的生物量產量并未受到明顯影響，說明在本實驗條件下至少可以實現4次循環，經過4個輪次的循環培養，可使水的消耗量減少約75%。是否能實現無限次循環或者需要采用何種技術加以補充可以實現無限次循環還需要進一步實驗觀察。

對于循環培養，除考慮水的回收利用，還需要關注營養素的回收利用。在工、農業污水用于微藻培養的時候，經過一次培養一般只有部分營養素會被消耗完全，在新一輪培養前需要補充[29]，其他未消耗完的營養素可繼續利用。本研究是基于食品應用的蛋白核小球藻的培養，在此情形，一般用BG11等配方培養基，有時會加糖混養或添加NaHCO3等增加碳源提高生長速度和生物量產量。食用小球藻生產用的新配培養基成分比較確定，由于食品安全的需要，培養基成分也比較明確。所以，本研究采用以BG11為基礎來研究循環培養中的營養素消耗與補充問題。在本研究中，通過分析比較補充完全BG11培養基和補充基于BG11減少某些成分的各培養基配方對小球藻在循環培養中生物量的影響，明確在循環培養中蛋白核小球藻對營養鹽的不同需求，從而達到節省營養鹽成本的目的。結果表明補充完全BG11或補足BG11中的N、P、S鹽都可以在4個循環內維持蛋白核小球藻的生物量和生長速率。本文僅進行了4輪培養，如果在更多輪循環培養時，除N、P、S的其他營養鹽分別在經過多少輪循環后需要補充，需要進一步研究。

4 結論

蛋白核小球藻培養廢水可以回收用于下一輪培養，此循環培養至少可以進行4次后再排放廢水。經過4個輪次的循環培養，可使水的消耗量減少約75%。在以BG11基礎培養基的循環培養中，每次循環只要補加N、P、S鹽即可維持小球藻的正常生長，其他營養鹽成分至少在3個循環內不必補充。利用培養廢液實現小球藻循環經濟培養和減少生產排放是可行的。

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A Recycling of Culture Medium of

FU Hong-yu1,2, LI Yan-qun1,2,3, CAI Qi-zhen1, LIANG Hao-hui1,2, LI Zhao-ping1,2, HU Xue-qiong1,2

（1.,/ 2./ 3.,., 524088,）

【Objective】To investigate whether the recycled water after harvestingcould be reused for the algal cultivation.【Method】The cycling medium was prepared with the remaining culture liquid after harvesting algae cells at the end of the last cultivation batch, and then was used to the next batch of cultivation. The total or partial complement of nutrients was based on the recipe BG11 of microalgae. The biomass and the growth ofwas indirectly indicated by the optical density .【Result】At the end of the 4th successive cultivation batch, the optical density(600 nm) of broth was 9.9 and the specific growth rate was 0.80 d-1, which did not show any significant decrease comparing with the biomass concentration and the algal growth rate at the end of the first batch. After 4 successive cultivation batches, the water consumption was reduced about 75%. Only when it was supplemented with the nutrients of nitrogen, phosphorus and sulfur in successive cultivation, the change of biomass ofwas controlled within 10% in two cycles. 【Conclusion】The results showed that under the condition of adding sugar, maintaining continuous illumination and having total complement of nutrients based on the recipe BG11, at least four cultivation batches ofcould be carried out. When it had only complement of nitrogen, phosphorus and sulfur nutrients,the growth ofcould be keep in 2 successive cultivation batches. It is feasible to realize the circulatory economic cultivation ofand reduce production emissions by the recycledwaste water.

, microalgal cultivation, recycle of culture medium

Q949.99

A

1673-9159（2019）04-0049-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.008

2019-03-19

廣東省自然科學基金（2015A030313616）；廣東省國際合作項目（2017A050501038）；湛江市科技計劃項目（2015A03026）

符虹宇（1991－），女，碩士研究生，研究方向為微藻生物活性物質研究與開發。E-mail：445363248@qq.com

李雁群（1963－），男，博士，教授，研究方向為發酵工程。E-mail：liyq2004@126.com

符虹宇，李雁群，蔡奇珍，等. 蛋白核小球藻培養液的循環利用[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（4）：49-55.

（責任編輯：劉朏）