馬氏珠母貝β2腎上腺素能受體（β2AR）分子特征和表達分析

張雨婷，曾嫚玉，馬佳儀，李嘉欣，焦 鈺,，杜曉東

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馬氏珠母貝腎上腺素能受體（）分子特征和表達分析

張雨婷1，曾嫚玉1，馬佳儀1，李嘉欣1，焦 鈺1,2，杜曉東2

（1. 廣東海洋大學水產學院 / 2. 廣東省珍珠養殖與加工工程技術研究中心，廣東 湛江 524088）

【目的】研究馬氏珠母貝（）腎上腺素能受體（）的生物學功能?！痉椒ā坷胏DNA末端快速擴增技術（RACE）克隆獲得基因的cDNA的全長序列并對其序列特征進行分析，實時熒光定量技術（qRT-PCR）檢測馬氏珠母貝不同組織中基因mRNA的表達水平?！窘Y果與結論】的cDNA全長2 426 bp，包括開放閱讀框（ORF）2 091 bp，編碼696個氨基酸，5′UTR長144 bp，3′UTR長191 bp，預測分子質量79.0 ku，理論等電點9.18，多重序列比對結果發現在不同物種間的保守性較高。軟件分析結果顯示的氨基酸序列具有7個典型的跨膜結構域。qRT-PCR結果表明，基因在各組織中均有表達，在鰓中表達量最高，在肝胰腺和性腺中表達量也較高。

馬氏珠母貝；腎上腺素能受體；分子特征；表達分析

腎上腺素能受體（beta 2 adrenergic receptor，）屬于G蛋白偶聯受體（G Protein-Coupled Receptors，GPCR）家族，在體內可被腎上腺素激活[1]。參與調控免疫細胞[2-3]，以及膠質細胞、成纖維細胞、上皮細胞等的調控[4-6]。腎上腺素能受體有3個亞型，分別是、、，在同種動物體內這3種受體的氨基酸同源性接近50%，同一種受體的同源性在不同種類動物之間可達75%及以上[7]。含有7個跨膜α螺旋結構域，有3個細胞外環，其中一個是氨基末端，3個細胞內環，有羧基末端[8]。

調節免疫反應是通過G蛋白依賴的G蛋白偶聯受體激酶2信號通路（G-protein-coupled receptor kinases，GRK2）和抑制蛋白2（β-arrestin2）信號通路。被相應的配體激活后被GRK2磷酸化，后β-arrestin 2移動至細胞膜并結合磷酸化的受體，使該受體與G蛋白結合，可促進內化和脫敏[4]。在炎癥反應細胞因子網絡中發揮免疫抗炎功能，通過抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）生成、阻止白細胞黏附和減少毛細血管通透性等[9]。研究表明，在神經系統對免疫的調控中，交感神經可以通過釋放神經遞質，激活細胞表面的腎上腺素能受體，通過介導神經遞質發揮細胞免疫功能[2]。去甲腎上腺素刺激后單核或者巨噬細胞產生的抗炎因子增加、促炎因子減少[10]。關于的功能報道，在軟體動物中僅見于縊蟶[11]，在馬氏珠母貝中尚未見相關報道。

馬氏珠母貝（），屬于軟體動物門雙殼綱，又稱合浦珠母貝（），是海水珍珠養殖的重要經濟物種，其生長環境的特殊性，使其易于被病原體和微生物侵染[12]。目前對貝類病害的相關研究尚不成熟，致使我國貝類養殖業發展緩慢，因此貝類免疫相關基因研究具有重要的現實意義。本研究利用cDNA末端快速擴增技術（RACE）克隆獲得基因的cDNA的全長序列并對其序列特征進行分析；實時熒光定量技術（qRT-PCR）檢測馬氏珠母貝不同組織中基因mRNA的表達水平，分析馬氏珠母貝關于免疫和應激反應的相關基因，了解其免疫機制，以期為提高馬氏珠母貝抗病能力和降低插核后的免疫排斥提供理論支持，為進一步探究在貝類免疫機制中的生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 實驗用貝為大小一致、生長狀況良好的2齡馬氏珠母貝，用于qRT-PCR的材料取自貝體的外套膜套膜區（MP）和中央膜（MC）、閉殼肌（A）、鰓（GI）、血細胞（B）、性腺（GO）、足（F）和肝胰腺（HE），RACE擴增所用材料為馬氏珠母貝的性腺和鰓。樣品取出后立即放于液氮中速凍，超低溫冰箱-80 ℃保存。感受態細胞DH5α保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 實驗試劑 Trizol Lipofectamine?2000 CD購買于Invitrogen公司，Reverse Transcriptase M-MLV、SMARTer RACE 5′/3′Kit、rTaq酶、PMD-18T Vector購買于TaKaRa公司，GeneJET PCR Purification Kit購買于Thermo Scientific公司。

1.1.3 引物設計 根據馬氏珠母貝珍珠囊轉錄組文庫中篩選出注釋基因高度相似的unigene序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA第一鏈的合成 分離馬氏珠母貝的各組織，在2.5 mL離心管中加入1 mL Trizol后，再加入約100 mg組織量，經組織研磨儀研磨后參照Trizol試劑說明書抽提馬氏珠母貝各組織的總RNA。分別取各組織2 μL用于瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀[（260 nm）/（280 nm）比值]檢測其完整性、濃度及純度。根據Reverse Transcriptase M-MLV SMARTer RACE 5′/3′ Kit說明書，反轉錄合成cDNA第一鏈[13]。

1.2.2基因的克隆 使用巢式PCR依次進行中間片段、5′端、3′端的擴增。將產物純化回收后連接至pMD18-T載體，再轉入DH5α感受態細胞中，經細菌基礎培養基LB培養后，挑取單一陽性克隆樣品送至上海生工進行測序[14]。

表1 本實驗所用引物

1.2.3 序列分析 利用DNAMAN軟件將中間片段與5′端、3′端片段進行拼接，獲得了全長cDNA。利用在線工具ORF Finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）對基因進行開放閱讀框（ORF）和氨基酸序列的預測；利用ExPASY（http://web.expasy.org/ protparam/）分析其理化性質；利用SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal/）預測其是否有信號肽；經Motif（http://myhits.isb-sib.ch/cgi -bin/motif_scan）對其進行功能位點的預測；利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/）進行結構域預測；用SWISS-MODEL（http:// swissmodel.expasy.org/）預測的3級結構；采用MEGA7的 Neighbor-Joining 法構建進化樹，檢驗 Bootstrap 值并設置抽樣次數為 500 次；利用DNAMAN軟件對馬氏珠母貝與已知的不同動物氨基酸多序列進行比對[15]。

1.2.4 實時熒光定量檢測組織差異表達 以為內參基因，各組織的反轉錄cDNA為模板，反應體系（10 μL）：10 μmol/L的上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 0.5 μL，SYBR?Select Master Mix 5 μL，滅菌的ddH2O 3.7 μL。反應條件：95 ℃下預變性 2 min，95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火 1 min，40個循環，添加1個溶解曲線。每個樣品進行重復 3 次進行。采用2-ΔΔCT分析法，樣本重復性和組織間差異性利用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 Pmβ2AR基因cDNA全長的克隆及序列分析

克隆得馬氏珠母貝（）894 bp 的5′ 端上游序列和415 bp 的3′ 端下游序列，拼接后得到2 426 bp的全長cDNA。其中5′UTR為144 bp，3′UTR為191 bp，包含3′末端25 bp的poly A尾巴。開放閱讀框長2 091 bp，編碼696個氨基酸（圖1）。

2.2 Pmβ2AR氨基酸序列理化性質

預測分子質量約為69.0 ku，理論等電點為9.18。氨基酸序列中帶負電荷氨基酸殘基（Asp和Glu）共63個，正電荷數的氨基酸殘基（Arg和Lys）共80個。預測此氨基酸不穩定指數（II）為46.35，將此蛋白質分類為不穩定蛋白；親水指數為-0.398，為親水蛋白（圖2），N-端不存在信號肽；具有跨膜區域，表明該蛋白不是胞質蛋白。經預測，氨基酸序列在73~342位含有7個跨膜結構域，在371~440位含有兩個低復雜度結構域，對蝦夷扇貝進行結構域分析得知其具有相同的7個跨膜結構域（圖3）。氨基酸序列中其他功能位點包括cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點5個，n-糖基化位點10個，酪氨酸激酶磷酸化位點1個等。經SOPMA 軟件預測其二級結構，α螺旋為33.19%，延伸鏈（Ee）為17.96 %，β轉角（Tt）為4.17%，無規則卷曲（Cc）為44.68 %。用SWISS-MODEL軟件預測蛋白分子的三維結構，與蝦夷扇貝有較高相似性（圖4）。

2.3 Pmβ2AR的多序列比對和同源性分析

采用DNAMAN軟件將與珍珠雞（, XP_021266164.1)、墨西哥麗脂鯉（，XP_007232946.2）、熱帶爪蟾（，NP_001116897.2）和蝦夷扇貝（，OWF49060.1）的氨基酸序列進行多序列比對分析，結果顯示，與蝦夷扇貝的相似性最高為70%（圖5）。將的氨基酸序列用NCBI與其他物種進行對比，得到小鼠（，NP_031446.2）、馬氏珠母貝、蝦夷扇貝、地中海果蠅（，XP_023159092.1）、智人（，NP_000015.1）、斑馬魚（，NP_001082940.2）、亞洲水牛（，XP_006052758.1）、綠頭鴨（，XP_005010059.3）、美洲牡蠣（，XP_022294171.1）、美洲鱟（，XP_013791385.1）、紅鰭東方鲀（，XP_011609112.1）、多疣壁虎（，XP_015262106.1）、青鳉（，XP_015232667.1）、熱帶爪蟾和長牡蠣（，XP_011439690.1）的氨基酸序列，以NJ法構建系統進化樹，結果顯示，脊椎動物聚為一個分支；馬氏珠母貝與蝦夷扇貝聚為一簇，與蝦夷扇貝的親緣關系最近，結果與傳統的分類相吻合（圖6）。

5′ 和 3′ 非編碼區用小寫字母表示; 始密碼子ATG和終止密碼子TAG用方框標注; 雙劃線部分為7個跨膜結構域；陰影部分為2個低復雜區；虛線部分為cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點；單劃線部分為n-糖基化位點；波浪線部分為酪氨酸激酶磷酸化位點

5′ UTR and 3′ UTR are indicated with small letters; Nucleotide with a frame represents the initiation codon (ATG) and stop codon (TGA); The double underline sequence represents 7 Transmembrane region; The shaded part represents 2 low complexity; The dashed underlined sequence represents cAMP and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation sites; The single underlined sequence represents n-glycosylation sites; The wavy underlined sequence represents indicates tyrosine kinase phosphorylation sites

圖1基因的核酸序列分析

Fig. 1 The nucleotide sequence analysis of

“+”: 疏水性 Indicates hydrophobicity; “-”: 親水性 Indicates hydrophilicity

圖3 Pmβ2AR蛋白質結構域

圖4 蝦夷扇貝（A）、馬氏珠母貝（B）β2AR蛋白分子結構

“*”與灰色背景均表示保守的氨基酸

“*”and the gray background indicated the conserved amino acid

圖5結構域區的氨基酸序列多序列比對

Fig. 5 Multi-sequence alignment of amino acid sequence of Pdomains

圖6 基于NJ法構建的β2AR系統進化樹

2.4 Pmβ2AR的組織表達分析

在馬氏珠母貝的血細胞、鰓、閉殼肌、性腺、肝、中央膜區、足和套膜區中均有表達，在鰓中表達量最高（< 0.05）；其次是肝胰腺和性腺，在閉殼肌中表達量最低。

MP: 套膜區; A: 閉殼肌; MC: 中央膜區; HE: 肝胰腺; GI: 鰓; F: 足; B:血細胞; GO: 性腺; 凡有一個標記相同字母即為差異不具統計學意義（> 0.05）

MP: Pallial zone; A: Adductor muscle; MC: Central zone; He: Hepatopancreas; GI: Gill; F: Foot; B: Blood cells; GO: Gonads; Same letters indicated no significant difference（＞0.05）

圖7在馬氏珠母貝不同組織中的表達分布

Fig. 7 Expression distribution ofin different tissues from

3 討論

目前的研究主要集中在脊椎動物中，無脊椎動物中特別是海洋軟體動物的研究極少。本實驗通過軟件分析顯示氨基酸序列與其他物種的具有相似的7個跨膜結構。經軟件預測沒有信號肽，氨基酸序列分析認定為親水蛋白。是受體蛋白，分布在3個細胞相中，而N端位于細胞外表面并延伸到疏水區域，其與細胞內和細胞外的親水環相接觸，與前人關于的研究相符合[16-17]。同源性分析顯示基因在不同物種間保守性較高，其中與蝦夷扇貝的相似性為70%，進化樹分析顯示兩者聚為一支，表明兩者遺傳上關系較近，同屬于軟體動物這一類別。

為進一步探討的功能，我們檢測了在馬氏珠母貝中不同組織中的表達量情況，發現在鰓中表達量最高，其次是肝胰腺和性腺。Christine等[18]的研究表明在腮腺組織中高表達，高表達有利于傷口修復。軟體動物的鰓和人類的皮膚一樣，是抵御有害環境的主要防御屏障。馬氏珠母貝的鰓直接與環境接觸，對水中的細菌和有害物質起到過濾作用[19]。鰓具有豐富的毛細血管，能促進血管舒張，鰓中還具有各種抗菌活性成分，并能進行多種酶類分子的合成、某些應激反應等過程[20]。在馬氏珠母貝鰓中高表達，推測其可能在抵抗各種外界環境刺激時發揮了作用，但具體的功能仍需進一步驗證。在性腺中的高表達表明與生殖細胞的成熟過程、減數分裂密切相關[21]，這與在縊蟶各組織中的相對表達一致[11]。貝類沒有特異性免疫，肝胰腺可分泌各種免疫酶來對抗外來物的干擾[22]。筆者推測，在貝體受到外界刺激后，激活GRK2或β-arrestin2通路，促進肝胰腺分泌免疫酶來對抗外界刺激，這進一步說明了肝胰腺在貝類先天性免疫中的作用。

在免疫調節方面具有重要作用。在人體中，能調解支氣管擴張、血管舒張和促進去甲腎上腺素釋放[23]。在炎癥反應中，使新生大鼠心肌成纖維細胞中的 IL-6 和 TNF-α升高[24]。TNF-α即腫瘤壞死因子-α，主要作用是調節免疫細胞的功能，作為一種內源性致熱源，它能夠促使發熱，引起細胞凋亡；IL-6 是白細胞介素的一種，其作為促炎細胞因子和抗炎性肌球蛋白起作用[25]。在縊蟶水管損傷修復過程中，表達量的上升與介導 TNF-α和 IL-6 的合成并在炎癥反應中發揮作用有關。

4 結論

本研究成功克隆了基因的全長，預測的cDNA全長是2 426 bp，包括開放閱讀框（ORF）2091 bp，編碼696個氨基酸，5′UTR長144 bp，3′UTR長191 bp，預測分子質量79.0 ku，理論等電點9.18。蛋白為親水蛋白，N-端不存在信號肽，具有7個典型的跨膜結構域。多重序列比對結果表明在不同物種間的保守性較高。NJ法構建系統進化樹結果表明，馬氏珠母貝與蝦夷扇貝聚為一簇，與蝦夷扇貝的親緣關系最近。qRT-PCR結果表明，基因在各組織中均有表達，在鰓中表達量最高，在肝胰腺和性腺中表達量也較高。

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Molecular Characterization and Expression Analysis ofAdrenergic Receptor () from

ZHANG Yu-ting1, ZENG Man-yu1, Ma Jia-yi1, Li Jia-xin1, JIAO Yu1,2, DU Xiao-dong2

（1./ 2.,524088,）

【Objective】To study the biological function of（）. 【Methods】The full length ofgene was cloned using rapid amplification of cDNA end technology（RACE）and its sequence characteristics were analyzed. Meanwhile, the expression ofmRNA in different tissues ofwas detected by Real-time PCR（RT-PCR）.【Result and conclusion】It shows that the total length ofgene was 2 426 bp, including 2 091 bp of the open reading frame（ORF）which encoded 696 amino acids, a 5′ untranslated region of 144 bp and a 3′ untranslated region of 191 bp. The predicted molecular weight was 79.0 ku, and the isoelectric point was 9.18. Multiple sequence alignment results showed thatwas conservative among different species. Domain analysis showed that the amino acid sequence ofhad 7 typical transmembrane domains. In addition, qRT-PCR indicated thatwas expressed in all the detected tissues, and the highest expression level was in the gills, followed by hepatopancreas and gonads.

;; molecular characterization; expression analysis

Q954.4

A

1673-9159（2019）04-0108-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.04.016.2019.04.016

2019-04-01

國家自然科學基金（31672626）

張雨婷（1995－）女，碩士研究生，研究方向為水產養殖學。Email：zytgou@163.com

焦鈺，女，副教授，研究方向為生物化學與分子生物學。Email：jiaoyu1981@hotmail.com

張雨婷，曾嫚玉，馬佳儀，等. 馬氏珠母貝β2腎上腺素能受體（）分子特征和表達分析[J].廣東海洋大學學報，2019，39（4）：108-114.

（責任編輯:劉朏）