燕麥片成品優(yōu)勢(shì)菌的篩選及燕麥菌落總數(shù)新檢測(cè)閾值的建立

閆驍驤

摘? 要：通過對(duì)燕麥成品優(yōu)勢(shì)菌的培養(yǎng)、篩選、分離和純化，建立新的檢測(cè)閾值并驗(yàn)證，結(jié)果表明，在36℃、GB4789.2-2016規(guī)定的正常檢測(cè)接種量的培養(yǎng)條件下，檢測(cè)培養(yǎng)40h后，當(dāng)菌落總數(shù)小于270cfu時(shí)，菌落總數(shù)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果<10000cfu，食品安全符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。將燕麥片成品優(yōu)勢(shì)菌株經(jīng)過篩選、分離純化和培養(yǎng)后，重新接種于平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，對(duì)其生長特性進(jìn)行研究，以期縮短燕麥菌落總數(shù)檢測(cè)時(shí)間，為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)參數(shù)的更新提供參考。

關(guān)鍵詞：燕麥;優(yōu)勢(shì)菌;菌落總數(shù);菌落檢測(cè)

中圖分類號(hào) TS210.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）12-0125-3

燕麥作為一種新興的健康食品，其功能性成分包括但不限于β-葡聚糖、燕麥硒、燕麥酚酸、生物堿、可溶性膳食纖維、類黃酮、植酸、亞油酸、α-亞麻酸等，具有獨(dú)特的營養(yǎng)優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前，隨著燕麥片生產(chǎn)工藝的逐步成熟和改進(jìn)，其成品的檢測(cè)技術(shù)不斷向前發(fā)展，將推動(dòng)麥類相關(guān)檢驗(yàn)技術(shù)的更新，進(jìn)而影響到燕麥和其他麥類行業(yè)相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立與完善。為此，本研究開展了燕麥片成品優(yōu)勢(shì)菌株的篩選實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 采用公司實(shí)驗(yàn)室篩選的燕麥優(yōu)勢(shì)菌株。主要試劑和儀器如表1和表2所示，其他設(shè)備和材料按照GB4789.2-2016中第3章節(jié)的要求購買使用。供應(yīng)培養(yǎng)基：采用GB4789.28-2013規(guī)定的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。pH自然，121℃高壓滅菌15min備用。

1.2 樣品處理 利用GB4789.1-2016三級(jí)采樣方法和樣品處理方法，對(duì)燕麥成品進(jìn)行隨機(jī)抽樣。將25g燕麥片溶解于225mL生理鹽水（10倍稀釋度），接種量實(shí)驗(yàn)以此比例為基準(zhǔn)進(jìn)行濃縮;菌落數(shù)量測(cè)定實(shí)驗(yàn)，根據(jù)需要同步展開若干個(gè)10倍梯度稀釋培養(yǎng)觀察過程，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3 燕麥優(yōu)勢(shì)菌株的篩選 首先，對(duì)燕麥片成品優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行初步培養(yǎng)和篩選，采用朔州市朔煤古城食品有限公司車間生產(chǎn)的燕麥片成品作為待檢樣品，按照國標(biāo)GB4789.1-2016和GB19640-2016中規(guī)定的取樣方法進(jìn)行取樣，其中n=5，c=2，m=104，M=105。采用國標(biāo)GB4789.2-2016中操作要求的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定的實(shí)驗(yàn)操作。采用外徑約為95mm、內(nèi)徑約為90mm的玻璃培養(yǎng)平皿，傾倒培養(yǎng)基厚度控制在0.35～0.45mm，接種后在超凈工作臺(tái)正置約15min后，在恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h。然后挑取形態(tài)完整、菌落邊緣清晰的優(yōu)勢(shì)菌，梯度稀釋平板法進(jìn)一步分離純化并重復(fù)試驗(yàn)。之后針對(duì)再培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行均勻涂布接種培養(yǎng)，分別觀察燕麥片大小片成品共6批次樣品。優(yōu)勢(shì)菌落形態(tài)均呈現(xiàn)表面白色圓形，邊緣整齊光滑，有酵母菌特有香氣，符合酵母菌的菌落形態(tài)常見特征，判定為酵母菌。之后采用GB4789.15-2016霉菌與酵母計(jì)數(shù)中提及的選擇性培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（簡稱PDA）培養(yǎng)，生物顯微鏡涂片觀察，得到的分離純化后的菌株作為檢測(cè)出發(fā)菌株。

1.4 燕麥菌株生長特性指標(biāo)的測(cè)量 結(jié)合燕麥產(chǎn)成品國標(biāo)檢測(cè)要求，并充分考慮到酵母菌的菌落形態(tài)特性，邊緣整齊，易于觀察，對(duì)每個(gè)被均勻稀釋涂布的平皿出現(xiàn)的酵母菌落進(jìn)行觀察。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)之前的實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)立5組平行實(shí)驗(yàn)，菌落生長特性指標(biāo)結(jié)果，表示為酵母菌落個(gè)數(shù)平均結(jié)果（cfu/皿）。驗(yàn)證試驗(yàn)采用GB4789.2-2016中的規(guī)定方法，進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)酵母菌落生長特性的影響 燕麥片成品在平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基培養(yǎng)下的優(yōu)勢(shì)菌為酵母菌，酵母菌理論最適生長溫度為20～30℃。由于國標(biāo)要求檢測(cè)方法的額定培養(yǎng)溫度為36℃，為了探測(cè)36℃培養(yǎng)條件下的燕麥優(yōu)勢(shì)酵母菌株的生長情況，實(shí)驗(yàn)設(shè)定溫度梯度為3℃，實(shí)驗(yàn)中采用梯度稀釋法。設(shè)立同一樣品的菌懸液，相同稀釋度、相同接種量、不同溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察所得結(jié)果見表3。由表3可知，燕麥優(yōu)勢(shì)酵母菌株菌落長勢(shì)的最佳培養(yǎng)溫度在30～33℃附近。不同培養(yǎng)溫度對(duì)燕麥優(yōu)勢(shì)酵母菌株菌落個(gè)數(shù)影響力比例為30℃∶33℃∶36℃∶39℃≈2∶1.81∶1.49∶1。

2.3 不同初始接種量對(duì)菌落生長特性的影響 實(shí)驗(yàn)中采用梯度稀釋法，設(shè)立同一樣品、相同稀釋度的菌懸液，不同倍數(shù)接種量條件下進(jìn)行培養(yǎng)后觀察。與溫度和時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)不同的是，為了更好地對(duì)接種量進(jìn)行控制，本次實(shí)驗(yàn)采用的是單獨(dú)批次的燕麥片成品稀釋液，采用的培養(yǎng)基是PCA培養(yǎng)基，測(cè)定的是菌落總數(shù)。所得結(jié)果見5表。由表5可知，不同初始接種量對(duì)燕麥優(yōu)勢(shì)酵母菌株菌落總數(shù)影響力比例為n×1∶n×2∶n×3∶n×4≈1∶1.83∶3.83∶8.38。

3 燕麥菌落總數(shù)檢測(cè)新閾值的設(shè)立與驗(yàn)證

綜上所述，燕麥優(yōu)勢(shì)酵母菌最佳培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間48h后仍然保持較旺生長，燕麥片成品檢測(cè)樣接種量與菌落總數(shù)結(jié)果接近倍數(shù)關(guān)系。以此為據(jù)，設(shè)定新的檢測(cè)閾，采用平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)40h展開第1次觀測(cè)，而后繼續(xù)培養(yǎng)至48h，再觀察1次。記錄的都是菌落總數(shù)。與接種量單因素實(shí)驗(yàn)同步展開驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，根據(jù)設(shè)立閾值，每個(gè)接種量分別設(shè)計(jì)5組平行實(shí)驗(yàn)并觀測(cè)整理菌落總數(shù)結(jié)果均值。

檢測(cè)閾值設(shè)立方式如下：結(jié)合上述影響力比例數(shù)據(jù)，設(shè)定培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時(shí)間40h，接種量為1倍，閾值300cfu;培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時(shí)間40h，接種量為2倍，閾值550cfu;培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時(shí)間40h，接種量為3倍，閾值1150cfu;培養(yǎng)時(shí)間40h，接種量為4倍，閾值2520cfu（這里的1倍接種量指的是25g燕麥片溶于225mL無菌生理鹽水，移液槍吸取1mL，接種在平板上，標(biāo)記為10倍稀釋度的接種量，接種量若干倍就是通過上述基礎(chǔ)更改料液比進(jìn)行濃縮，每次吸取1mL進(jìn)行接種的量，下文同）。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時(shí)間40h，接種量為1倍，40h結(jié)果均值270cfu，48h結(jié)果均值1500cfu;培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時(shí)間40h，接種量為2倍，結(jié)果均值490cfu，48h結(jié)果均值2800cfu;培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時(shí)間40h，接種量為3倍，結(jié)果均值980cfu，48h結(jié)果均值5400cfu;培養(yǎng)時(shí)間40h，接種量為4倍，結(jié)果均值1900cfu，48h結(jié)果均值9850cfu，均未超過設(shè)立的檢測(cè)閾值，也符合GB19640-2016規(guī)定的菌落總數(shù)測(cè)定項(xiàng)合格標(biāo)準(zhǔn)，新檢測(cè)閾值建立成功。

4 結(jié)論與討論

通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在36℃，GB4789.2-2016規(guī)定的正常檢測(cè)接種量的培養(yǎng)條件下，檢測(cè)培養(yǎng)40h，如果菌落總數(shù)小于270cfu，則本次菌落總數(shù)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果<10000cfu，食品安全符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)中，設(shè)立檢測(cè)閾值用的是針對(duì)燕麥優(yōu)勢(shì)酵母菌株的選擇性培養(yǎng)基，而驗(yàn)證檢測(cè)閾值的時(shí)候用的是平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，使結(jié)果更接近真實(shí)工作檢測(cè)流程發(fā)生的結(jié)果。通過鎖定優(yōu)勢(shì)菌以及觀察其生長特性，從而給設(shè)定新檢測(cè)閾值打下基礎(chǔ)。此外，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃縮倍數(shù)的接種量并未帶來同比例的菌落總數(shù)增益效果，可能是由于燕麥成品中的β-葡聚糖的抗真菌作用[1-3]。因此，通過新檢測(cè)閾值的設(shè)立與驗(yàn)證，可以為燕麥行業(yè)菌落總數(shù)項(xiàng)目檢測(cè)提供一定的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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