HLA-B27基因亞型與漢族人群強直性脊柱炎遺傳易感性的研究*

余建林，譚立明，蔣永清，吳瓊，陳娟娟，李華，吳洋，曾婷婷，田永建

[南昌大學第二附屬醫院 檢驗科（江西省檢驗醫學重點實驗室）江西 南昌 330006]

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是一種自身免疫性疾病，主要累及骶髂關節及中軸關節，病因目前仍不明確[1]。目前AS 的診斷主要依靠影像學結合臨床表現，其早期診斷和治療受到限制，明確診斷時多為中晚期，嚴重影響患者的生活質量，因此，早期診斷AS 具有重要的臨床意義。臨床工作中發現南昌地區漢族人群AS 患者HLA-B27 陽性率高于其他疾病人群。有文獻報道[2-4]AS 患者HLA-B27基因具有高陽性率和多種基因亞型，地區和人群間存在差異，對AS 的早期診斷有一定意義。本研究選取南昌地區漢族人群AS、類風濕關節炎（rheumatoid arthritis,RA）、腰椎盤間盤突出（lumbar intervertebral disc herniation,LIDH）、脊柱結核（spinal tuberculosis,ST）和骨關節炎（Osteoarthritis,OA）等患者及健康體檢者進行HLA-B27基因亞型分析，為該地區AS 的早期診斷及治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1 ～12月南昌大學第二附屬醫院門診及住院AS 患者74 例（AS 疾病組）。其中，男性49 例，女性25 例；年齡17 ～63 歲，平均（31.88±3.19）歲。RA 患者65 例。其中，男性18 例，女性47 例；年齡22 ～66 歲，平均（36.88±2.59）歲。LIDH 患者51 例，其中，男性27 例，女性24 例；年齡18 ～67 歲，平均（31.65±2.78）歲；ST 患者50 例。其中，男性27 例，女性23 例；年齡17 ～66 歲，平均（30.49±3.78）歲；OA 患者53 例。其中，男性23 例，女性30 例；年齡24 ～67 歲，平均（34.84±2.14）歲。患者均符合柏林診斷標準[5]。健康體檢人群40 例（健康對照組）。其中，男性18 例，女性22 例；年齡16 ～67 歲，平均（31.45±2.78）歲。所有研究對象均為南昌地區漢族人群。各組年齡、性別比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。將RA 和OA 合并為關節炎癥疾病（關節炎癥疾病組），LIDH 和ST 合并為非關節炎癥性脊柱疾病（非關節炎癥脊柱疾病組）。本研究經南昌大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準，所有血液樣本均在患者知情同意條件下獲得。

1.2 儀器與試劑

流式細胞儀BD FACS Calibur（上海智巖科學儀器有限公司），PCR 儀器ABI2720（南京貝登醫療股份有限公司），ABI 3730XL 測序儀（上海佰真生物科技有限公司），配套的分析軟件為Accu Type。HLA-B27抗原檢測試劑：FITC 標記的抗-HLA-B27、PE 標記的抗-CD3、溶血素；HLA-B27基因亞型測定試劑：TBG Biotechnology Corp HLAssure 試劑盒（臺灣基亞生物科技股份有限公司），SE SBT kit 批號分別為AA15111K，AB15111K，AC15111K，AX15111K，AQ15111K。制備DNA 模板試劑：EXTRA-GEN 試劑盒（鹽析，上海信帆生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 HLA-B27 檢測①取抗-HLA-B27 FITC/CD3 PE 試劑30 μl 與50 μl 充分混勻的抗凝血（確保白細胞的濃度在3.5×103～9.4×103個/μl）混勻后室溫避光靜置15 ～20 min；②混勻靜置后的血液中加入2 ml 的溶血素，混勻避光室溫靜置10 ～12 min；③靜置后的血液離心吸取上清液后，留取約50 μl 細胞液加入2 ml PBS 洗滌細胞；④向洗滌后的細胞加入0.25 ml 1% 甲醛固定30 min；⑤將染色好的細胞在BD FACS Calibur 流式細胞儀進行檢測，操作方法及結果判斷均嚴格按照儀器和試劑盒說明書及南昌大學第二附屬醫院質量管理標準文件進行。

1.3.2 HLA-B27基因亞型檢測采用PCR-SBT 技術分析AS 患者及健康對照人群HLA-B27基因亞型。①DNA 模板制備：為保證測序所得結果的可靠性，將DNA 在260 nm 處吸光度與280 nm 處吸光度（A260/ A280）的比值控制在1.65 ～1.80。②PCR 擴增：TBG Biotechnology Corp HLAssure SE SBT kit試劑盒； 擴增條件：95℃預變性5 min；93℃變性30 s，63℃退火40 s，72℃延伸2.5 min，共36 個循環。72℃再延伸5 min；降溫至4℃，完成PCR 擴增。③凝膠制備：依據制膠系統操作說明書，配置2%瓊脂糖凝膠加入溴化乙錠，使溴化乙錠濃度為0.5 μg/ml；在10 V/cm 的電壓條件進行跑膠，直到甲酚紅到達距離膠上緣1.4 ～2.0 cm 處。④PCR 擴增產物分析：紫外光觀察箱觀察，再使用影像分析系統確認PCR 產物的質量。⑤基因亞型分析：5 μl 特異性測序反應體系（其中含有HLA-B27 的特異性正反向引物，正向引物：5'-GGTCCAAGACGAGGAGGTTC-3'；反向引物：5'-GGTGGGACAGGAATTAG-3'）。測序反應條件：96℃預變性2 min；96℃變性10 s；50℃退火5 s；60℃延伸4 min，共25 個循環。在純化測序反應產物后使用熒光標記雙脫氧法測序運用PCR-SBT 技術進行HLA-B27基因亞型分析檢測，使用配套的分析軟件Accu Type 分析HLA-B27等位基因。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計數資料以百分率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義，采用χ2分割法進行組間兩兩比較，校正后α=0.007，P＜0.007 為差異有統計學意義。

表1 各組HLA-B27 人群分布 例（%）

2 結果

2.1 HLA-B27 檢測結果

流式細胞儀HLA-B27 檢測結果見圖1。

圖1 HLA-B27 流式細胞儀檢測結果

2.2 HLA-B27 表達分布情況及分型

AS 疾病組HLA-B27 陽性率與關節炎癥疾病組、非關節炎癥性脊柱疾病組及健康對照組比較，差異有統計學意義（χ2=183.54，P=0.000），AS 疾病組高于其他3 組。見表1。

2.3 HLA-B27 陽性人群性別及年齡分布

30 ～＜40 歲年齡人群中男性人群的HLA-B27 陽性率為46.55%，高于女性人群23.08%（χ2=5.506，P=0.016）。見表2。

表2 HLA-B27 陽性人群年齡及性別的分布

2.4 HLA-B27 陽性人群不同疾病及性別分布

AS 疾病組中男性人群的HLA-B27 陽性率為87.76%，高于其他組別的男性人群陽性率（χ2=103.150，P=0.000）；女性人群HLA-B27 陽性率為84.00%，高于其他組別的女性人群的陽性率（χ2=75.450，P=0.000）。見表3。

2.5 HLA-B27基因亞型分析

AS 疾病組HLA-B27基因亞型分為B2704 48 例、B2705 14 例、B2707 1 例、B2709 1 例；非AS 疾病組與健康體檢人群HLA-B27 基因各亞型陽性人數少，不能進行統計學分析，合并后再與AS 疾病組各基因亞型比較，其中與B2704、B2706 和B2709 比較，差異有統計學意義（χ2=34.153、32.919 和21.162，均P=0.000）。而與B2705 比較，差異無統計學意義（χ2=3.414，P=0.056）。見表4 和圖2。

表3 HLA-B27 陽性人群不同疾病及性別分布

表4 疾病組及健康對照組HLA-B27基因亞型測序結果

圖2 疾病組及健康對照組HLA-B27基因亞型測序圖

3 討論

AS 是一種自身免疫性疾病，好發于青年男性，主要表現為骶髂關節和脊柱關節炎癥，致殘率高，嚴重影響患者的生活質量[5-6]。發病率與種族相關，歐洲人群、亞洲人群、拉丁美洲人群分別為0.186%、0.180%和0.122%[3]，相對女性患者，男性的發病年齡較年輕，延誤診治的時間長，脊柱的活動度較差[5]。AS 的發病與多種因素有關，如蛋白質錯誤折疊、腸道細菌和肺炎克雷伯桿菌感染[7-11]。AS 的診斷主要依靠影像學和臨床表現，當患者出現典型影像學改變和臨床表現時，常常已發展到中晚期，導致延誤診斷和治療。HLA-B27 是位于人體第6 號染色體短臂上的一個等位基因；由一條分子量為4.4×104的a 鏈和一條分子量為1.2×104的b 鏈組成[12]。HLA-B27 主要作用是參與特異性免疫應答，在抵御外界病毒入侵時具有重大作用[13-14]。研究顯示AS 與HLA-B27 呈強關聯，AS 患者中約90%以上具有HLA-B27 抗原，健康對照人群只有7%左右[10，15-17]。HLA-B27 具有多種基因亞型，主要亞型為B2704、B2705，另有B2702、B2706、B2707、B2709 等；其中B2704、B2705 與AS 有高相關性[18-20]，而B2706、B2709 則被認為是保護性的基因亞型[22]。

本研究南昌漢族人群AS 疾病陽性率為86.49%；明顯高于關節炎癥疾病患者11.02%（RA 和OA）、非關節炎癥型脊柱炎疾病患者6.93%（LIDH 和ST）疾病患者及健康體檢人群5.00%。以上數據顯示該地區HLA-B27基因在漢族AS 患者中具有較高的陽性率，與AS 的發病具有相關性，且是AS 的發病的高危因素之一。在臨床癥狀相似的疾病中，HLA-B27 抗原的檢測具有鑒別診斷的意義。該地區的AS 患者中HLA-B27 陽性率低于相關文獻報道[15-16]，提示該地區人群與相關文獻報道的人群具有種族差異性；HLA-B27基因具有不同的表現。其他非AS 的相似疾病組HLA-B27 陽性率與健康人群相比較無差異；而AS 疾病組中具有較高的陽性率，提示HLA-B27 抗原能夠用于鑒別診斷AS 及相關的自身免疫性疾病。30 ～＜40 歲組的男性人群的HLA-B27 抗原檢出率高于女性，AS 好發于青年且男性多見[21]，與實驗結果相符合。

文獻報道韓國地區的AS 患者HLA-B27基因亞型主要為B2705（90.9%），而B2704（7.7%）[19]；土耳其地區AS 人群HLA-B27基因亞型主要為B2705（65.2%），而B2702（26.1%）[22]；在中國漢族AS 人群主要的基因亞型為B2704 與B2705，而歐洲白種人群主要基因亞型為B2705 及B2702。AS 組人群中B2704 亞型檢出率為75.0%（48/64），明顯高于其他疾病組人群；B2705 亞型的檢出率為21.8%（14/64），與非AS 疾病組和健康體檢人群的差異無統計學意義。證明B2704 基因亞型是南昌地區漢族AS 患者的主要基因亞型，也是AS 易感基因亞型。本實驗尚不能認為基因亞型B2705 與AS 具有相關性，與相關文獻報道不一致[22]。提示HLA-B27 具有種族差異性，不同地區人群的HLA-B27 主要基因亞型不同。其他疾病組及健康對照組HLA-B27基因亞型分析數據量少，單獨做統計分析意義不大；將其他疾病組與健康組合并后與AS 疾病進行對比分析，得出B2709 基因亞型主要在非AS 疾病組及健康組人群中。

以上實驗數據分析得出，南昌地區漢族人群AS 的發病主要為男性青年人群；且HLA-B27 陽性的人群患病率較HLA-B27 陰性的人群高。性別及HLA-B27基因亞型為AS 發病的危險因素。HLA-B27抗原檢測及基因亞型分析可以作為該地區診斷AS 的輔助指標，對于臨床表現可疑的男性青年患者，若發現B2704 的基因亞型，可以盡早采取有效的措施，早期干預疾病的發展，從而減低AS 疾病的致殘率，提高患者的生活質量，延長生存期限。因此，HLA-B27 亞型檢測對該地區的AS 治療和鑒別診斷具有重要意義。