先天性腎積水患兒尿水通道蛋白-1、內皮素-1表達水平及臨床意義

曹戌，周云，嚴向明，張婷，付明翠，夏紅亮，戴澍

（蘇州大學附屬兒童醫院 泌尿外科，江蘇 蘇州 215000）

先天性腎積水是小兒泌尿外科常見疾病，發病率為1%～2%。腎盂輸尿管連接部狹窄、膀胱輸尿管反流、后尿道瓣膜病、輸尿管狹窄及輸尿管囊腫是其常見病因，如不及時治療常導致終末期腎衰竭[1-2]。腎小球血流動力學的改變及腎小管功能的變化是先天性腎積水的病理生理學因素。現已知積水腎臟早期的功能變化為濃縮功能受損[3-4]，但其發生機制尚不完全明確。水通道蛋白-1（Aquaporin-1,AQP-1）是一種參與水分子轉運的特異性通道蛋白，主要分布于近曲小管的頂膜和基底膜。AQP-1 的缺失或表達下降將導致髓袢降支細段水通透性的降低，從而影響腎臟的濃縮功能。LI 等[5]的動物實驗表明，缺失AQP-1 的小鼠多表現為中度多尿，且尿滲透壓降低至正常的1/10。因此，AQP-1 在腎臟濃縮功能方面發揮著重要作用[6]。由于AQP-1 亦可由腎小管上皮細胞分泌，存在于尿中。且動物模型已證實，梗阻腎臟腎盂中尿AQP-1 的表達水平會降低。因此，尿AQP-1 水平可能與積水腎臟的功能變化密切相關。本研究旨在通過對積水患兒手術前后尿AQP-1 表達情況的研究，獲得相應的臨床線索。

內皮素-1（Endothelin-1,ET-1）是一種在多種細胞中均能合成的多肽，在不同組織發揮不同的生物學作用。在腎臟中，ET-1 可促使腎動脈及腎小球系膜細胞收縮，減少腎小球濾過面積，降低腎血流量及腎小球濾過率[7]。ALALEH 等[8]、LOPES 等[9]的動物實驗表明，隨著梗阻時間延長，梗阻側腎盂尿ET-1 含量較對照組增加，梗阻側腎組織中的ET-1 蛋白含量也較正常對照組升高，而對側腎臟組織及尿ET-1 的變化并不明顯。提示ET-1 主要是在梗阻側腎臟合成的。因此，與AQP-1 類似，尿ET-1 水平可能與積水腎的損害程度及術后恢復情況相關。國內外有這方面報道，本文希望探討尿ET-1 表達水平與先天性腎積水患兒的臨床相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本文為前瞻性研究，選取2017年1月—2018年 1月于蘇州大學附屬兒童醫院泌尿外科就診的40 例先天性腎積水患兒作為實驗組。所有患兒在術前完成超聲、靜脈腎盂造影（IVP）、膀胱造影、ECT、泌尿系CT 等影像學檢查，以明確腎積水診斷及病因，并評估積水程度。腎積水的診斷及分度依據HALBGEWACHS等[10]、SHARIFIAN 等[11]、SFU 分級法[12]提出的標準進行（見表1、2）。另選40 例于本院就診的患兒作為對照組，該患兒無泌尿系統疾患。對照組排除標準為：①嚴重的心臟、肝臟疾患；②腎功能異常；③泌尿系疾患；④自身免疫性疾病；⑤惡性腫瘤。

表1 腎積水診斷標準及分度

表2 SFU 分級

1.2 一般資料

實驗組患兒40 例。男性26 例，女性14 例；平均年齡（28.05±5.46）個月。30 例患兒的病變區域位于左側，7 例位于右側，3 例為雙側。當診斷標準發生沖突時，以評級較高的診斷標準定級。實驗組輕度積水11 例、中度積水15 例，重度積水14 例。病因分析：30 例（30%）為腎盂輸尿管連接部狹窄（uretero-pelvic junction obstruction,UPJO），10 例（10%）為膀胱輸尿管連接處梗阻（uretero-bladder junction obstruction,UVJO）。30 例UPJO 患兒均行腎盂成形術并保留雙“J”管和導尿管；10 例UVJO 患兒均行輸尿管膀胱再植術并保留導尿管。對照組患兒40 例。男性17 例，女性23 例；平均年齡（29.14±6.27）個月。

1.3 標本采集

收集實驗組患兒術前晨尿、術中腎盂尿及術后7 d 尿。對照組則僅收集晨尿。所有患兒每日補液量約100 ml/kg，且晚上10：00 ～晨7：00 不飲水及補液。將所收集的尿標本在室溫下按3 000 r/min 離心20 min，真空冷凍干燥機對尿標本進行20∶1 濃縮，貯存于-80℃冰箱冷凍保存待測。

1.4 尿AQP-1 及ET-1 濃度的檢測

尿AQP-1 及ET-1 濃度檢測采用美國RB 公司的人AQP-1、ET-1 ELISA 試劑盒，并嚴格按照產品說明書進行測定。

本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA 法，用人抗AQP-1、ET-1 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的AQP-1、ET-1 與單抗結合，加入生物素化的人抗AQP-1、ET-1 形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化酶標記的Stre Ptavidin 與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450 nm 處測OD 值，AQP-1、ET-1 濃度與OD 值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中AQP-1、ET-1 濃度。

1.5 實驗流程及觀測指標

①測量實驗組不同腎積水程度下尿AQP-1 的濃度，與對照組進行比較；②測量實驗組在術前、術中及術后尿AQP-1 的濃度，比較3 個時期尿AQP-1 的濃度變化；③測量實驗組及對照組尿ET-1 的濃度及陽性率，進行組間比較；④測量實驗組術前、術后的血清應激指標，組內比較。血清應激指標包括：血清腎上腺素濃度、血糖、皮質醇、白細胞介素-6（Interleukin-6）及C-反應蛋白（C-reactive protein,CRP）。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組之間的比較采用完全隨機設計及隨機區組設計的方差分析，在其有統計學意義的基礎上兩兩比較用SNK-q檢驗。計數資料以率（%）表示，比較做χ2檢驗分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同腎積水程度下患兒尿AQP-1 濃度比較

實驗組輕、中、重度先天性腎積水患兒尿AQP-1濃度分別為（40.0±2.9）、（36.1±4.9）及（31.3±3.4）ng/L。對照組患兒尿AQP-1 濃度為（41.1±3.5）ng/L。4 組 尿AQP-1 濃度比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=103.143，P=0.000）；輕度腎積水患兒尿AQP-1濃度與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），中度腎積水患兒尿AQP-1 濃度與對照組比較降低（P＜0.05），重度腎積水患兒尿AQP-1 濃度與對照組比較降低（P＜0.05）。

2.2 手術前后患兒尿AQP-1 濃度比較

實驗組患兒術前、術中、術后尿AQP-1 濃度分別 為（33.5±4.7）、（24.9±4.0）及（35.2±4.5）ng/L，比較采用隨機區組設計的方差分析，結果：實驗組術前、術中、術后不同時期患兒尿AQP-1 濃度比較，差異有統計學意義（F=50.741，P=0.025）；實驗組術中尿AQP-1濃度比術前尿AQP-1 濃度降低（P＜0.05），術后尿AQP-1 濃度比術中尿AQP-1 濃度升高（P＜0.05）；實驗組患兒術后尿AQP-1 濃度與對照組（41.1±3.5）ng/L 比較，差異有統計學意義（t=4.252，P=0.000）。

2.3 兩組患兒尿ET-1 濃度及陽性率比較

當尿ET-1 濃度≥845.00 pg/mmol Cr（pg/mmol Cr是指經尿肌酐校正過的尿檢測結果）時，可認定尿中ET-1 陽性。尿ET-1 濃度實驗組術前為（2 034.41± 892.14）pg/mmol Cr，陽性率為77.50%，陰性率為22.50%。對照組的濃度為（568.20±212.35）pg/mmol Cr，陽性率為10.00%，陰性率為90.00%。兩組比較，尿ET-1 濃度差異有統計學意義。見表3。

2.4 兩組患兒血清應激指標的變化

兩組患兒術前血清應激指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）（見表4）；實驗組患兒術后腎上腺素、血糖、IL-6 術后均高于術前（P＜0.05）；而皮質醇、CRP 術后水平與術前水平差異無統計學意義（P＞0.05）（見表5）。

表3 兩組患兒尿液ET-1 濃度及陽性率的比較 （n=40）

表4 實驗組術前與對照組血清應激指標的比較 （n=40，±s）

表4 實驗組術前與對照組血清應激指標的比較 （n=40，±s）

組別 腎上腺素/（ng/ml）血糖/（mmol/L）皮質醇/（ng/ml）IL-6/（pg/ml）CRP/（mg/L）實驗組 0.17±0.05 4.59±0.35 230.95±18.55 12.43±2.44 12.19±2.38對照組 0.17±0.04 4.60±0.35 231.06±18.65 12.44±2.40 12.18±2.40t值 9.632 12.418 10.911 9.841 10.724P值 0.841 0.627 0.735 0.816 0.794

表5 實驗組術后與對照組血清應激指標的比較 （n=40，±s）

表5 實驗組術后與對照組血清應激指標的比較 （n=40，±s）

組別 腎上腺素/（ng/ml）血糖/（mmol/L）皮質醇/（ng/ml）IL-6/（pg/ml）CRP/（mg/L）實驗組 0.27±0.05 5.90±0.41 256.35±20.08 16.80±2.52 15.47±2.61對照組 0.17±0.04 4.60±0.35 231.06±18.65 12.44±2.40 12.18±2.40t值 36.542 42.715 31.139 47.385 27.703P值 0.037 0.045 0.057 0.043 0.162

3 討論

AQP-1 最初由AGRE 等在紅細胞及腎小管上皮細胞膜上發現[13]，隨后又陸續從動物組織中鑒定出9 種水通道蛋白，即AQP-2 至AQP-10。不同亞型的AQP分布于不同組織的細胞膜上，并與分子轉運、水電解質平衡、腺體分泌等功能相關。AQP-1 至AQP-4 是參與腎臟重吸收及濃縮功能的重要通道蛋白，其中又以AQP-1 的功能最為關鍵。近曲小管是腎臟重吸收的主要功能部位，AQP-1 主要分布于近曲小管頂膜和基底膜，在髓襻降支細段與逆流倍增機制中發揮關鍵性作用。正常成年人每日腎小球濾過率約180 L，90%通過近曲小管的AQP-1 完成轉運。WANG 等[14]通過單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）大鼠模型發現：當梗阻發生時，腎臟AQP-1 的表達明顯下調，腎臟濃縮功能在梗阻早期即受到影響。ZELENINA 等[15]分析解除梗阻后腎臟AQP-1 表達的變化情況，發現當梗阻解除后的2 d，AQP-1 的表達開始恢復，在梗阻解除后的7 d 可有恢復，而在梗阻解除的21 d，AQP-1 的表達可基本恢復至原水平。以上研究都反映出AQP-1 的表達與腎積水的病理生理變化密切相關。

本研究中，實驗組患兒尿ET-1 陽性率及濃度均高于對照組。提示尿ET-1 表達水平可作為先天性腎積水患兒的輔助診斷指標。TOPCU 等[16]曾測定單側UPJO 患兒尿中ET-1 水平。研究顯示，當將診斷標準設為3 fmol/mg.Cr 時，通過尿ET-1 水平診斷腎積水的敏感性為74.3%，特異性為90%，整體精度為81.5%。此外，該患兒尿ET-1 水平在腎盂成形術后12 個月顯著降低。TATA 認為尿ET-1 不僅可以作為診斷先天性腎積水的輔助診斷指標，還可作為術后恢復的監測指標。需要注意的是，TATA 等在研究中僅檢測了術后1年患兒尿ET-1 水平，尿ET-1 水平究竟在梗阻解除后早期（12 周），還是在中晚期（＞12 周）時恢復，不得而知。此外，由于ET-1 與腎小球動脈硬化、腎間質纖維化密切相關，而腎臟在梗阻發生后的早期并不表現出纖維化等改變，尿ET-1 可能不宜作為積水腎臟的早期損傷指標，這可能會影響到ET-1 對腎積水的診斷效率。類似的，當梗阻解除后，腎纖維化、腎小球硬化的恢復亦是緩慢的過程，尿ET-1 作為腎積水術后恢復的監測指標可能缺乏敏感性。綜上所述，尿ET-1 的表達水平與腎積水的病理生理變化密切相關，但其作為腎積水診斷指標及術后恢復監測指標的敏感性，可能不如AQP-1，需進一步臨床試驗加以分析研究。

綜述所述，尿AQP-1 及ET-1 水平可作為先天性腎積水患兒的輔助診斷指標。此外，尿AQP-1 還可作為腎積水患兒術后恢復的監測指標。