不同基材復配紫薯花青素制備智能指示膜及其應用

蔣光陽，肖力源，王章英，陳安均，吳賀君，張志清,*

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.廣東省農業科學院作物研究所，廣東 廣州 510000 ）

食品智能包裝是通過對食品包裝的內部環境進行實時監視，獲取食品在貯運期間品質安全信息的技術，根據功能的不同將其分為時間-溫度指示型、氣體泄露指示型和新鮮度指示型[1]。其中新鮮度指示型智能包裝是利用食品在貯運過程中釋放的一些特征氣體與試劑產生特征顏色、溫度反應等引起內部指示劑顏色變化，從而得到食品實時信息[2]。

許多天然聚合物，如淀粉、殼聚糖、果膠、瓊脂等由于其低毒性、可降解性、相容性好等特點被廣泛用作成膜基材[3-4]。然而智能指示膜的制備除了需要成膜基材外，主要還有指示劑的選擇，有研究發現質量分數3%溴甲酚紫溶液、聚苯胺、溴百里酚藍作為指示劑能及時傳達出食品內部的實時信息[5-6]。但是，合成敏感材料具有毒性，用于包裝食品對人體健康有一定危害；因此開發天然安全無毒的指示劑顯得尤為重要。花青素屬于水溶性天然色素，對人體無危害，主要結構為2-苯基苯并吡喃陽離子，其會隨pH值的改變顯示不同顏色，可滿足膜中指示劑的要求。目前，天然色素作為智能指示膜的指示劑也成為了國內外研究的熱點之一。桑葚花青素提取液、葡萄皮花青素提取液、藍莓花青素提取液、玫瑰花青素提取液等在智能指示膜指示劑的應用中已取得一定的成果[7-8]。肉制品在貯藏過程中，蛋白質的分解會產生許多的揮發性物質，導致pH值上升，但新鮮度指示型智能包裝可以及時反映肉制品的新鮮度。Chun等[9]將溴甲酚綠作為檢測鯖魚新鮮度的指示劑，觀測鯖魚魚肉新鮮度的實時變化。Zhai Xiaodong等[10]將聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）和淀粉作為成膜基材加入玫瑰花青素制成指示膜，并用于魚肉貯藏期間新鮮度的檢測，隨著魚肉貯藏時間的延長，覆蓋在魚肉上的指示膜顏色由紅色變為淺藍色。Liu Bin等[11]的研究以PVA和淀粉作為成膜基材、紫薯花青素作為指示劑制備指示膜并實時監測牛奶新鮮度的變化。Choi等[12]以瓊脂作為成膜基材、以紫薯花青素作為指示劑制備智能指示膜用于檢測豬肉在25 ℃條件下新鮮度的變化，但瓊脂的顏色對花青素顏色變化會有一定的影響。

本研究以可降解材料淀粉、羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl-cellulose sodium，CMC）、魔芋葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KMG）兩兩互配為成膜基材，并加入天然紫薯花青素作為成膜指示劑，通過流延法制備指示膜。并比較不同基材指示膜間力學性能、水溶性、微觀結構、相容性、顏色穩定性及顯色效果，以期為紫薯花青素應用于智能指示膜提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯（‘廣紫2號’，2017年11月收獲），由廣東省農業科學院作物所提供。新鮮活草魚，購買于四川省雅安市農貿市場，每尾約1.2 kg。

馬鈴薯淀粉（水分質量分數17.52%、直鏈淀粉質量分數21.62%、脂肪質量分數0.025%、蛋白質量分數0.018%）寧夏萬里淀粉有限公司；KGM 金陽泰興農業有限責任公司；中速濾紙 美國沃特曼公司；CMC、丙三醇、無水乙醇（分析純） 成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

RE-200B型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；Sartorius CP225D型電子天平 德國賽多利斯公司；UV-3100N紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 江蘇榮華儀器制造有限公司；TA.XT Plus質構儀 北京超技儀器有限公司；FJ200-SH數顯恒速高速分散均質機 上海壘固儀器有限公司；148-121型螺旋測微器 鄭州中天實驗儀器有限公司；Ultra型掃描電子顯微鏡 德國卡爾-蔡司股份公司；Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 美國熱電公司；SC-10便攜式色差儀 蘇州欣美和儀器有限公司；玻璃成膜板（23 cm×28 cm）或有機成膜板為自制；EW-73B單反照相機 日本佳能公司。

1.3 方法

1.3.1 紫薯花青素提取

將紫薯于60 ℃干烘至恒質量，粉碎機打粉過60 目篩備用（紫薯粉水分質量分數6.75%）。稱取一定量紫薯粉，按料液比1∶10（m/V）加入體積分數40%乙醇溶液（提取劑），60 ℃水浴攪拌3 h，濾紙抽濾兩次收集濾液[12]。于50 ℃旋轉蒸發（避光）得到花青素濃縮液，真空冷凍干燥48 h得到紫薯花青素粉。

1.3.2 紫薯花青素光譜特征

紫薯花青素在不同的pH值條件（pH 2～12）下，使用相機記錄花青素溶液的顏色變化，并通過紫外-可見分光光度計進行可見光光譜掃描，波長范圍在400～800 nm之間[12]。

1.3.3 智能指示膜的制備

取6 g馬鈴薯淀粉（starch，S）溶于100 mL蒸餾水中，95 ℃攪拌糊化15 min后備用；取0.6 g KGM溶于100 mL蒸餾水中備用；取1.2 g CMC溶于100 mL蒸餾水中備用[13]。將3 種制備好的溶液分別按照質量比1∶1進行兩兩混合，分別制備KCG/淀粉（KS）混合液、淀粉/CMC（SC）混合液、KCG/CMC（KC）混合液，在這3 種混合液中均依次加入質量分數1%丙三醇、質量分數0.2%紫薯花青素粉（P），10 000 r/min均質5 min，混合液經真空、超聲除去氣泡后倒入板中，45 ℃烘箱中烘干成膜，得到紫薯花青素膜，分別記為KSP、SCP、KCP。揭膜后置于相對濕度（55±1）%、溫度（25±1）℃的恒溫恒濕箱中平衡48 h后測定性能[14]。

1.3.4 智能指示膜的表征

1.3.4.1 膜厚度的測定

參照GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的測定 第3部分：薄膜和薄片的試驗條件》[15]，采用電子數顯千分尺測定，選取膜的對角和中心點進行測定，取平均值用于其他各項物理性能計算，單位為mm。

1.3.4.2 力學性能的測定

使用TA.XT Plus質構儀測定膜的抗拉強度和斷裂伸長率，將膜裁剪為80 mm×15 mm的薄條，將初始距離設置為50 mm，測定速率為50 mm/min。每組樣品測試8個平行樣品，拉伸強度、斷裂伸長率分別按照公式（1）、（2）進行計算。

式中：F表示膜斷裂時承受的最大張力/N；b表示膜寬度/mm；d表示膜的厚度/mm；L表示膜斷裂時的長度/mm，L0表示膜的初始長度/mm。

1.3.4.3 膜水分質量分數、水溶性測定

將坩鍋放在105 ℃烘箱中烘至恒質量，稱取質量為m1/g的膜放入恒質量坩鍋，在105 ℃烘箱中烘至恒質量（m2/g），每組重復測定3 次[16]。水分質量分數按式（3）進行計算。

在室溫下將在105 ℃烘箱中烘至恒質量（m1/g）的膜浸泡在50 mL蒸餾水中，24 h后倒出浸泡液，將其放入105 ℃烘箱中烘至恒質量（m2/g），每組重復測定3 次[16]。水溶性按式（4）進行計算。

1.3.4.4 膜顏色穩定性的測定

將3 種智能指示膜分別放置于溫度4 ℃或25 ℃、相對濕度75%的恒溫恒濕箱中2 周，每隔2 d利用色差儀對膜的色澤（L、a、b）進行測定，并按公式（5）計算色差（ΔE）[17]。

式中：L、a、b分別為膜放置后的測定值；L0、a0、b0為膜放置前初始測定值。

1.3.4.5 掃描電子顯微鏡分析

測定前將樣品裁成2 cm×2 cm的試樣，45 ℃干燥24 h，用液氮將智能膜冷凍斷裂，真空濺射噴金，通過掃描電子顯微鏡觀察3 種智能指示膜的橫截面結構并拍照，加速電壓為10 kV。

1.3.4.6 FTIR分析

將成膜材料和3 種智能指示膜在45 ℃干燥箱中烘至恒質量，利用FTIR儀測定樣品的吸收光譜，掃描范圍為650～4 000 cm-1。

1.3.4.7 魚肉新鮮度檢測的應用

將去皮后的魚肉切成10 g/塊并去刺備用，將綜合性能較優的紫薯花青素膜裁成大小為3 cm×3 cm的小塊并覆蓋在魚肉上一起放入培養皿中，用保鮮膜包裹并置于25 ℃的恒溫恒濕條件下貯藏48 h。隔12 h測定膜的顏色（L、a、b值）變化，計算出ΔE，同時使用相機記錄SCP膜顏色的變化；并根據GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》測定魚肉的總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量[18]。

1.4 數據統計與分析

結果以平均值±標準差形式表示，使用SPSS 20軟件進行數據處理，采用方差分析進行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 紫薯花青素溶液在不同pH值下的顏色及可見光譜

在不同pH值條件下，花青素會顯示出不同的顏色。由圖1a可知，當pH 2～12時，紫薯花青素的顏色隨溶液pH值的升高呈現出由深紅色→淺紅色→紫色→藍色→綠色→黃色。因為花青素在水溶液中不穩定，在特定的pH值環境中，黃烊鹽離子、醌式堿、甲醇假堿以及查耳酮4 種結構之間存在平衡，但隨著pH值的變化，各結構之間的轉換易受到影響，從而導致花青素水溶液顏色發生變化（圖1b）。當花青素在酸性介質中，紅色的黃烊鹽陽離子在介質中起主要作用，使得溶液呈現出紅色。水化平衡轉換是導致顏色變化的主要因素，花青素水溶液中黃烊鹽陽離子經水化平衡后轉變為共軛生色體被破壞的無色假堿，導致溶液中無色的甲醇假堿起主要作用，紅色逐漸退去。隨著pH值的不斷上升，花青素失去原本C環O上的陽離子，從而變為藍色醌式堿，導致原來黃烊鹽離子濃度以及色澤強度同時發生下降，溶液逐漸呈現出藍色。最后在強堿條件下花青素極不穩定而被降解，溶液變成黃色[19]。

圖1 不同pH值條件下紫薯花青素溶液顏色及結構變化Fig. 1 Changes in structure and color of purple sweet potato anthocyanin solutions under different pH conditions

由圖2a可知，當pH 2～5時，紫薯花青素顏色呈紅色或淺紅色，且隨著溶液pH值增加，紫薯花青素的最大吸收峰的波長從524 nm向556 nm遷移，吸光度也明顯下降。當花青素溶液的pH值升到7時，最大吸收波長增加到556 nm附近。當pH 8～12時，最大吸收光譜處于604 nm附近。

一般情況下，波長處于400～800 nm范圍內時，不同pH值的花青素吸光度能及時反映其互補顏色的色度，比如花青素在400～800 nm范圍內時，若可見光的波長為524 nm左右（綠光），在該波段下綠光被物體所吸收，顯示出其互補色（紅色），波長為604 nm左右（紅光），顯示顏色為綠光。因此在綠光和紅光波長下吸光度之間的比值（A604nm/A524nm）能反映其顏色的改變，比值越小，說明樣品紅色越深；比值越大，說明綠色越深。根據圖2b可知，當pH 2～9時，隨pH值增加，顏色由紅色變成綠色，且不斷加深，且A604nm/A524nm呈指數增長。指數方程為：y＝0.243 46+0.144 47e0.2950x（R2＝0.968 5），表明花青素的顏色變化符合朗伯-比爾定律，是一種很好的天然指示劑[12]。發色團和助色團組成色素，由于基團的不穩定性，酸堿或高溫等條件都會造成其結構發生轉變，從而導致其顏色發生變化，最大吸收波長和吸光度隨之不斷改變。

圖2 紫薯花青素在pH 2～12可見光譜吸收特征Fig. 2 Absorption characteristics of visible spectra of purple sweet potato anthocyanin solutions at pH 2-12

2.2 智能膜的特性

從表1可知，SCP、KCP、KSP 3 種膜之間的厚度存在差異。由于本研究智能膜的制備采用的是流延成膜法，因此在成膜過程中，成膜基材間分子內聚力和在成膜板上表面張力的差異導致了膜的性能差異。在實際應用中包裝膜要求有較好的機械強度，以避免在物品流通中造成損傷。抗拉伸強度和斷裂伸長率是衡量膜機械性能的重要參數[20]，由表1可知，拉伸強度從高到低依次為：SCP膜＞KSP膜＞KCP膜。SCP膜表現出最高的抗拉伸強度，膜的拉伸強度與膜分子結晶結構以及氫鍵有著密切的關系[21]；因此膜之間拉伸強度的差異可能由3 種原料之間羥基的數量不同而導致。KCP、SCP膜表現出較高的斷裂伸長率，且與KSP膜之間存在顯著性差異，說明KGM具有聚多糖高分子化合物的共性，在其分子鏈上有大量的羥基能與淀粉之間發生強烈的相互作用[22]。3 種智能指示膜的水溶性有著顯著性差異，水溶性從大到小依次為：KCP膜＞KSP膜＞SCP膜。Ghanbarzadeh等[23]研究發現將CMC添加到淀粉中制備可降解薄膜，薄膜內部分子間形成較強的相互作用，導致水分子不易進入，從而降低薄膜的水溶性，這可能是SCP膜水溶性較小的原因；而KCP膜水溶性較大可能與其內部結構有關系。

表1 智能指示膜的機械性能、水分質量分數及水溶性Table 1 Mechanical properties, moisture contents and water solubility of intelligent indicator fi lms

2.3 智能指示膜的FTIR分析

圖3 基材及智能指示膜的FTIR圖譜Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of fi lm-forming solutions and intelligent indicator fi lms

從圖3可以看出，成膜材料和3 種指示膜的紅外吸收光譜在3 385 cm-1附近對應有明顯的O—H鍵伸縮振動吸收峰，與馬鈴薯淀粉、KGM、CMC、紫薯花青素原料里面均含有豐富的羥基是一致的；在2 933 cm-1和2 888 cm-1處有明顯的吸收振動伸縮峰，此處由有機化合物的特征結構—CH2和—CH引起。SCP膜的紅外光譜圖在1 733 cm-1處有一個強度較弱的肩峰，是由黃酮類化合物結構中呋喃環伸縮振動引起[24]。此外紫薯花青素的紅外吸收光譜在1 636 cm-1和1 507 cm-1處的峰是芳香環骨架上C＝C鍵的振動引起，這與紫薯花青素提取物中含有豐富的芳香族化合物的特征峰極其吻合[4]。1 600 cm-1處為CMC的特征結晶峰，含有CMC的智能指示膜中對應的結晶峰發生了偏移，出現在1 593 cm-1處，表明智能指示膜內部分子之間已經形成了很強的分子間作用力，擾亂了CMC的正常狀態[25]。在馬鈴薯淀粉的光譜中1 081 cm-1處有明顯的吸收峰，可能是淀粉中C—O的伸縮和C—C的骨架振動的共同效果，在1 165 cm-1處的吸收峰是由C—O—C的伸縮振動以及C—C、C—H的骨架振動引起[26]，這些特征在KCP和KSP膜中均有體現。綜上所述，在制備該類智能包裝膜的過程中，各基材之間主要受分子間作用力影響，并依靠分子間作用力強弱影響膜性能表現，其基材的化學成分未發生明顯改變。由于此膜中的主要成分均為可降解的生物材料，加之成膜后成分未發生改變，可預測指示膜應用于食品包裝時對環境友好，可在自然環境中徹底降解。

2.4 智能指示膜的微觀結構

圖4 智能指示膜橫切面掃描電子顯微鏡圖（×1 000）Fig. 4 Scanning electron micrographs of the cross sections of intelligent indicator fi lms (× 1 000)

可以根據智能指示膜橫切面的均勻程度來進行判斷各成分之間的相容性，越粗糙其相容性越差[27]。如圖4所示，SCP膜的橫切面光滑緊密，未出現孔洞及裂痕，結構規整，表明其成分之間具有很好的相容性，與前文中優良的機械性能和相對較差的水溶性相吻合。KSP膜表面略帶有紋路，組分均一性差。KCP膜結構松散，橫截面帶有孔洞，導致其斷裂伸長率增加，抗拉伸強度降低，自由水易從其孔洞進入膜內部，導致其水溶性增強。

2.5 智能指示膜的顏色穩定性

圖5 智能指示膜在不同溫度下貯藏的色澤變化Fig. 5 Color change of intelligent indicator fi lms at different temperatures

當?E＜3.5時顏色變化小，肉眼不可察覺[28]。如圖5所示，在4 ℃和25 ℃條件下貯藏，3 種智能指示膜均表現出良好的顏色穩定性，可能是因為在溫度處于50 ℃以下時花青素的降解速率緩慢，從而指示膜顏色穩定性較好[29]；同時花青素與各種基材之間相容性較好，使得花青素受一定的保護作用[30]。其中SCP膜的穩定性強于其他兩種膜，可能是因為SCP膜表面更加光滑，且均勻致密，使得花青素被保護從而更加穩定，不易受外界環境影響。

2.6 智能指示膜在魚肉新鮮度檢測中的初步應用

圖6 魚肉貯藏期間TVB-N含量和智能指示膜顏色的變化Fig. 6 TVB-N values and color changes during storage of fi sh as determined by the starch/CMC indicator fi lm

由圖6A可知，隨著貯藏時間的延長，魚肉的TVB-N含量、?E均不斷升高。魚肉的初始TVB-N含量為6.53 mg/100 g，滿足GB 2733—2015《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》規定的新鮮魚肉中TVB-N含量應該小于15 mg/100 g；因此魚肉處于新鮮狀態，智能指示膜顯示出暗紅色。由圖6A、B可知，隨著貯藏時間的延長，膜的顏色越來越淺，當貯藏時間達24 h時，魚肉的TVB-N含量達15.2 mg/100 g，超過了GB 2733—2015規定的鮮度標準，此時指示膜顯示出淺紅色，?E為13.63，與魚肉新鮮時指示膜對比顏色變化明顯。當貯藏48 h時，魚肉的TVB-N含量達到36.47 mg/100 g，魚肉已經完全腐敗，此時智能指示膜顯示出淺藍色。魚肉貯藏過程中，在微生物和溫度的影響下，魚肉中會生成生物胺[31]，導致pH值增加，造成智能指示膜由淺紅色變為淺藍色，指示膜在48 h時?E達25.52，且顏色變化極其明顯；因此可以直接通過肉眼觀察到智能指示膜顏色的變化[32]，從而判斷魚肉新鮮度。綜上所述，通過貯藏過程中智能指示膜顏色的變化（暗紅色→淺紅色→淺藍色）能夠密切監視魚肉的腐敗過程。Zhai Xiaodong等[10]發現以玫瑰花青素為指示劑檢測魚肉新鮮度時，指示膜由紅色變為藍色，與本研究結果相似。

3 結 論

本研究所制備的SCP、KCP、KSP膜，膜中各組分相容性均較好；其中，SCP膜表現出很好的拉伸強度和斷裂伸長率，且阻水性能好。SCP膜的相容性最優，橫切面光滑緊密、結構規整，且顏色穩定性好。利用SCP膜對25 ℃下的魚肉進行新鮮度實時監測，魚肉在貯藏48 h的過程中，逐漸變得不新鮮，指示膜由暗紅色變為淺紅色，最后變為淺藍色。因此，紫薯花青素是智能指示膜理想的顯色材料，可用于指示魚肉新鮮度的改變。