3株獼猴桃細菌性潰瘍病致病菌的藥劑室內毒力比較

王瑞 雷霽卿 查仕連

摘要：為了篩選獼猴桃細菌性潰瘍病的有效防治藥劑，采用抑菌圈法比較28種殺菌劑對不同獼猴桃細菌性潰瘍病3株致病菌（PSA1、PSA2、PSA3）的室內毒力，并測定藥劑間復配對致病菌的聯合毒力。結果表明，28種殺菌劑中20%溴硝醇、20%葉枯唑、40%百菌清3種殺菌劑對PSA1的毒力效果較強，其EC50值分別為32.56、43.12、44.06 mg/L，均小于對照藥劑72%硫酸鏈霉素（對PSA1的毒力效果EC50值分別為44.56、54.56、77.82 mg/L）的毒力效果;而40%百菌清對PSA2和PSA3表現出較好的毒力作用，其EC50值分別為53.21、54.45 mg/L，優于對照藥劑硫酸鏈霉素。不同比例復配藥劑的室內毒力篩選發現，20%溴硝醇+20%葉枯唑（質量比為3 ∶ 1）和20%溴硝醇+40%百菌清（質量比為3 ∶ 1）2種復配劑對PSA1表現出較強的毒力，且為增效作用，均可作為田間獼猴桃細菌性潰瘍病的有效防控藥劑。

關鍵詞：獼猴桃;潰瘍病;殺菌劑;毒力測試;聯合毒力

中圖分類號： S482.2? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0141-03

獼猴桃是獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）多年生藤木植物，別稱毛桃、羊桃、奇異果（Kiwifruit）[1]，其果實含有大量的維生素、黃體素、氨基酸和天然肌醇，素有“水果之王”的美譽;此外，獼猴桃的根具有清熱解毒、活血散結、祛風利濕等功效[2]。近年來，世界范圍獼猴桃產業得到了持續發展，種植面積逐年增加，然而隨著生產規模逐漸擴大，管理不科學，導致獼猴桃病害問題日益突出，其中獼猴桃細菌性潰瘍病是一種嚴重威脅獼猴桃產業健康發展的重要病害，已成為制約獼猴桃產量的毀滅性因素，該病害的致病菌已確認為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidia）[3-8]，其主要危害獼猴桃樹的枝干、葉片和花，枝干受害后形成黃褐色或銹紅色的局部潰瘍腐爛，影響養分的輸送和吸收，造成樹勢衰弱，嚴重時可環繞莖桿引起樹體死亡。因此，對獼猴桃潰瘍病的防控進行深入研究，尋求有效的病害防控藥劑和方法是獼猴桃產業健康發展的重要保障。

目前，國內外對于該病害的藥劑防治主要依賴于銅制劑和農用鏈霉素，長期單一使用該類藥劑易使病原菌產生較強的抗藥性，從而導致防治效果下降[9]。采用合理的化學藥劑復配使用既可以提高防效、擴大防治譜的效果，又可以有效延緩病原菌的抗藥性，同時還可以降低田間病害的防控成本[10]。針對這一目的，筆者所在課題組前期發現乙蒜素、溴硝醇、代森錳鋅3種農藥在室內毒力和田間防治中效果較好[11-12]。為了篩選出更好的獼猴桃潰瘍病致病菌防控藥劑，在前期工作的基礎上，本研究分別從貴州省貴陽市修文縣1個貴長獼猴桃果園、貴州省貴陽市烏當區偏坡鄉2個紅陽獼猴桃果園獼猴桃植株患處分離、純化獲得3株丁香假單胞桿菌屬菌株，同時篩選了28種抗菌劑單劑對3株致病菌的室內毒力，并篩選了不同比例復配藥劑的室內毒力，為獼猴桃種植業中潰瘍病的綜合防控提供長效、高效藥劑基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 參照文獻[13-14]的方法，于2016年3—4月分別從修文縣谷堡鄉1個貴長獼猴桃果園、貴陽市烏當區偏坡鄉2個紅陽獼猴桃果園采集感病植株染病部位，于貴陽學院食品與制藥工程學院實驗室采用稀釋劃線法，分離純化得到潰瘍病發病部位細菌，經菌落PCR、美國國立生物技術信息中心（NCBI）基因庫Blast比對，獲得高同源性序列，分別與Pseudomonas sp. J3.1C9、Pseudomonas sp. SR64、Pseudomonas sp. WXBSY5同源性達99%，3株菌種屬于均丁香假單胞桿菌屬，分別命名為PSA1、PSA2、PSA3。

1.1.2 供試藥劑 20%溴硝醇可濕性粉劑（丹東市農藥總廠）;20%葉枯唑粉劑（山東拜耳化工有限公司）;80%多菌靈粉劑（英國邦農達農用化學品有限公司）;40%己唑醇懸浮劑（西安北農華農作物保護有限公司）;75%抑霉唑硫酸鹽粒劑、50%克菌丹粉劑（安道麥馬克西姆有限公司）;3%甲霜·霉靈水劑（天津市綠亨化工有限公司）;50%異菌脲粉劑[富美實（中國）投資有限公司];20%噻菌銅懸浮劑（浙江龍灣化工有限公司）、50%氯溴異氰尿酸粉劑（南京南農農藥科技發展有限公司）;60%唑醚·代森聯散粒劑、60%唑醚·代森聯散粒劑（青島奧迪斯生物科技有限公司）;75%三環唑粉劑（上海銳聯化工有限公司）;12.5%四氟醚唑水乳劑、70%甲基硫菌靈粉劑、41%甲硫戊唑醇懸浮劑（江蘇龍燈化學有限公司）;80%代森錳鋅粉劑（美國陶氏益農公司）;50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（江蘇省蘇州富美實植物保護劑有限公司）;37%苯醚甲環唑散粒劑（山東海訊生物化學有限公司）;80%烯酰嗎啉散粒劑（江西禾益化工股份有限公司）;70%氟環唑散粒劑、430 g/L戊唑醇懸浮劑、60%嘧菌酯散粒劑（北京華戎生物激素廠）;50%硫磺·多菌靈粉劑（江蘇藍豐生物化工股份有限公司）;26%嘧胺·乙霉威散粒劑（青島瀚生生物科技股份有限公司）;40%百菌清懸?。ㄈ毡緳M濱工廠）;5%烯效唑粉劑（江蘇劍牌農化股份有限公司）;3%噻霉酮粉劑（陜西西大華特科技實業有限公司）;對照藥劑為72%硫酸鏈霉素（四川長征普惠生物工程有限公司）。

1.1.3 供試培養基 營養瓊脂（NA）培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調pH值為6.8～7.0，121 ℃濕熱滅菌20 min備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥劑處理 首先將28種藥劑配制成1 000 mg/L的藥液進行初篩，對于毒力較好的單劑和復配制劑均設置 1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 mg/L 6個濃度梯度（以有效成分計），每個濃度設3個平行，另設清水為空白對照，農用鏈霉素為陽性對照。

1.2.2 測定方法 參照文獻[11，15]的方法，采用抑菌圈法測定28種單劑、復配劑對3株丁香假單胞桿菌的室內毒力。用無菌水配制含病原菌細胞106～107個/mL的菌懸液，每皿加入菌懸液1.0 mL，倒入至約10 mL、28 ℃的NA培養基，搖勻后制成平板。將直徑為6 mm的滅菌濾紙片放入各藥液內浸泡1 h，取出，放入平皿中，以無菌水浸泡濾紙為對照（CK），農用鏈霉素為陽性對照，置于28 ℃下培養，每個處理重復3次。48 h后觀察，測量抑菌圈直徑，計算抑制率，并以藥劑濃度為橫坐標、抑制率為縱坐標作回歸方程，得到各藥劑對獼猴桃潰瘍致病菌的抑制中濃度（EC50）。

1.2.3 毒力指數及混劑共毒系數的計算 根據文獻提出的方法[16-17]，選定試驗中的一種農藥為標準，計算出其余農藥單用或混用的毒力指數（設其標準農藥的毒力指數為100，毒力指數越大毒力越強）。

供試藥劑的毒力指數=標準藥劑的EC50供試藥劑的EC50×100%;

混劑共毒系數=混劑實際毒力指數混劑理論毒力指數×100%;

混劑實力毒力指數=標準藥劑的EC50混劑的EC50×100%。

混劑理論毒力指數=各單劑的毒力指數與其在混劑中含量的積的總和，共毒系數大于100為增效作用，等于100為相加作用，小于100為拮抗作用。

2 結果與分析

2.1 單劑的室內毒力

通過初步活性篩選，在濃度為1 000 mg/L的藥液濃度下，28種供試藥劑中有16種藥劑對PSA1、PSA2和PSA3 3株丁香假單胞桿菌致病菌表現出抑菌作用，其中包括20%溴硝醇、20%葉枯唑、40%百菌清、3%甲霜·霉靈、3%噻霉酮、50%異菌脲、80%代森錳鋅、40%己唑醇、50%克菌丹、20%噻菌銅、50%氯溴異氰尿酸、60%唑醚·代森聯、80%多菌靈、70%甲基硫菌靈、5%烯效唑、75%三環唑;而50%咪鮮胺錳鹽、37%苯醚甲環唑、80%烯酰嗎啉、75%抑霉唑硫酸鹽、60%嘧菌酯、50%硫磺·多菌靈、26%嘧胺·乙霉威、430 g/L戊唑醇、12.5%四氟醚唑、41%甲硫戊唑醇、70%氟環唑散粒劑、60%唑醚·代森聯12種抗菌劑對PSA1、PSA2和PSA3 3株丁香假單胞桿菌致病菌均未顯現出抑菌作用。由表1可知，20%溴硝醇、20%葉枯唑、40%百菌清3種殺菌劑對PSA1的毒力效果較強，其EC50值分別為32.56、43.12、44.06 mg/L，均小于對照藥劑72%硫酸鏈霉素（其對PSA1的毒力效果EC50值為44.56 mg/L）;而40%百菌清對PSA2和PSA3表現出較好的毒力作用，其EC50值分別為53.21、54.45 mg/L，優于對照藥劑硫酸鏈霉素;其他藥劑對PSA1、PSA2和PSA3的毒力效果EC50值均大于對照藥劑，僅表現出較弱的毒力活性。

2.2 藥劑復配的室內毒力

為了篩選出較理想的獼猴桃細菌性潰瘍病防控藥劑，測定20%溴硝醇、20%葉枯唑和40%百菌清不同復配比例藥劑對PSA1的聯合毒力，結果見表2。由表2可知，20%溴硝醇、20%葉枯唑和40%百菌清不同比例復配劑對PSA1的聯合毒力存在較明顯的差異，其中20%溴硝醇+20%葉枯唑（質量比為3 ∶ 1）和20%溴硝醇+40%百菌清（質量比為3 ∶ 1）2種復配劑對PSA1的共毒系數較大，分別為159.31、173.50，表現出較好的增效作用;而20%溴硝醇+40%百菌清（質量比為1 ∶ 3）和20%葉枯唑+40%百菌清（質量比為1 ∶ 1）2種復配劑對PSA1表現出拮抗作用，其共毒系數分別為92.62、80.40;其余復配劑表現出加和作用，共毒系數大約為100。

3 結論與討論

本試驗以3株丁香假單胞桿菌屬菌種PSA1、PSA2和PSA3為對象，采用抑菌圈法對28種殺菌劑進行室內毒力比較，發現20%溴硝醇、20%葉枯唑和40%百菌清對PSA1、PSA2和PSA3 3株致病菌表現出較好的毒力作用，其中20%溴硝醇、20%葉枯唑和40%百菌清對PSA1的毒力效果較強，其EC50值分別為32.56、43.12、44.06 mg/L，均小于對照藥劑72%硫酸鏈霉素。進一步的復配藥劑篩選發現20%溴硝 醇+20%葉枯唑（質量比為3 ∶ 1）和20%溴硝醇+40%百菌清（質量比為3 ∶ 1）2種復配劑對PSA1表現出較好的毒力效果，且表現出明顯的增效作用。本研究為后續田間防控試驗提供了重要藥劑，有望在田間的實際應用中替代硫酸鏈霉素。由于田間發病的因素較為復雜，是多因素共同作用的結果[18]，本試驗僅在室內篩選得到了較理想的防治藥劑，但仍需通過田間試驗得以證明，最終為貴陽市修文縣、烏當區乃至貴州省獼猴桃大規模種植中心區獼猴桃潰瘍病的綜合防治提供科學依據。

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