紅葉石楠類胡蘿卜素的提取與純化及抗氧化活性初探

黃志偉，董子鈺，范曉越，霍湘蕓，蔣耀瑛，王歲樓

（中國藥科大學 工學院，江蘇 南京 211198）

紅葉石楠是一種美麗的植物，葉子發芽后先紅后綠，一般作為行道樹養殖。在之前對紅葉石楠功能性色素的研究基礎上[1-3]，結合對香蕉皮中類胡蘿卜素的研究[4-6]，并進行紅葉石楠中類胡蘿卜素提取與純化方法的研究，旨在為紅葉石楠綜合利用及其功能性色素開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑：紅葉石楠葉，2018年4月采于中國藥科大學江寧校區；無水乙醇、丙酮、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、鹽酸等，均為分析純試劑。

儀器與設備：DFY-500型高速中藥粉碎機、DZF-6050型真空干燥箱、TU-1810型紫外可見分光光度計、KH-100B型超聲儀、RE-5205型旋轉蒸發器、離心機、全溫振蕩培養箱。

1.2 紅葉石楠預處理

石楠葉清洗，瀝干水分，放入烘箱干燥24 h，取出后真空干燥2 h。研磨過篩（100目），得紅葉石楠粉末試樣。

1.3 類胡蘿卜素提取

稱取試樣2 g，按一定料液比加入提取劑，在一定溫度下超聲提取一定時間。以轉速5 000 r/min離心提取5 min，取上清液即為類胡蘿卜素粗提液。

1.4 類胡蘿卜素含量測定

于波長450 nm處測定粗提液的吸光度，根據標準曲線計算類胡蘿卜素含量。

Y=0.073 6X+0.002 7.

式中：Y——吸光度；

X——提取量，μg/g。

1.5 單因素提取試驗

提取溶劑選擇：稱取2 g紅葉石楠粉末，分別加入石油醚、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、丙酮∶石油醚 （3∶7， 4∶6， 5∶5， 6∶4， 7∶3） 作為提取劑，在料液比1∶30（g∶mL），溫度40℃條件下超聲提取40 min。

提取料液比選擇：取4組樣品，每組稱取2 g紅葉石楠粉末。以丙酮作為提取劑，在40℃下，分別以料液比 1∶10，1∶15， 1∶20，1∶30（g∶mL）超聲提取40 min。

提取時間選擇：取5組樣品，每組稱取2 g紅葉石楠粉末。以丙酮作為提取劑，以料液比1∶20（g∶mL） 在40℃條件下超聲提取20，30，40，50，60 min。

提取溫度選擇：取5組樣品，每組稱取2 g紅葉石楠粉末。以丙酮作為提取劑，分別在30，40，50℃下超聲提取40 min。

提取率計算：

1.6 正交試驗優化提取工藝條件

采用L9（34）正交設計試驗，確定最優提取方案。

紅葉石楠類胡蘿卜素提取正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 紅葉石楠類胡蘿卜素提取正交試驗因素與水平設計

1.7 純化試驗方法

硅藻土活化，與洗脫劑進行濕法裝柱，加入類胡蘿卜素粗提液，用丙酮沖洗至液體無色，后用乙醇以一定的流速解析，得到純化后的紅葉石楠類胡蘿卜素溶液，于波長450 nm處測定吸光度，計算純化后溶液中類胡蘿卜素的含量。

（1） 洗脫劑選擇。以硅膠作吸附劑，上樣量2 mL。分別用丙酮、丙酮/石油醚 （7∶3，6∶4，3∶7） 及石油醚，以1 mL/min流速洗脫，測定流出液的吸光度。

（2） 吸附劑選擇。以丙酮∶石油醚7∶3作為洗脫劑，上樣量1 mL，分別用硅膠、硅膠/硅藻土（1∶1，1∶3，3∶1） 及硅藻土作為吸附劑，以1 mL/min流速洗脫，測定流出液的吸光度。

（3） 上柱量選擇。以丙酮/石油醚7∶3作為洗脫劑，硅膠/硅藻土1∶1作為吸附劑，分別加入0.5，1.0，1.5，2.0 mL的類胡蘿卜素粗提取液，以流速1 mL/min的流速洗脫，測定流出液的吸光度。

純化倍數計算：

1.8 類胡蘿卜素抗氧化活性測定

參考文獻[4]的方法，利用水楊酸法測定羥自由基清除率，評價紅葉石楠提取液抗氧化活性。

式中A0——空白對照溶液吸光度；

AX——樣品溶液吸光度；

AX0——不含過氧化氫的空白對照溶液吸光度。

2 結果與分析

2.1 提取試驗結果

溶劑對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見圖1，料液比對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見圖2，提取時間對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見圖3，提取溫度對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響見圖4。

圖1 溶劑對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響

圖2 料液比對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響

圖3 提取時間對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響

圖4 提取溫度對紅葉石楠類胡蘿卜素提取效果的影響

由圖1～圖4可知，不同的提取溶劑、料液比、提取溫度和提取時間都對提取效果有明顯的影響，最優提取條件初步可以確定為：以丙酮作提取劑，最佳料液比1∶15，最優提取溫度30℃，最優提取時間50 min。

石楠葉類胡蘿卜素提取的正交試驗結果見表3。

表3 石楠葉類胡蘿卜素提取的正交試驗結果

通過極差分析可知，各因素影響次序為料液比＞提取時間＞提取劑＞提取溫度；最優理論提取方案正好與正交試驗中提取量最大的第9號試驗條件組合一致為A3B3C2D1。因此，該試驗最優提取條件確定為提取溶劑為丙酮，提取時間60 min，提取溫度40℃，料液比1∶20（g∶mL），此時類胡蘿卜素提取量為529.43 μg/g。

2.2 純化試驗結果

洗脫劑對紅葉石楠類胡蘿卜素純化效果的影響見圖5，吸附劑對紅葉石楠類胡蘿卜素純化效果的影響見圖6，上柱量對紅葉石楠類胡蘿卜素純化效果的影響見圖7。

由圖5～圖7可知，最佳洗脫劑為丙酮∶石油醚7∶3，最佳吸附劑為硅膠∶硅藻土為1∶1，最佳上樣量為1.5 mL。經驗證試驗，按上述條件純化后類胡蘿卜素質量濃度47.94μg/mL（純化前類胡蘿卜素質量濃度26.47μg/mL），所以純化倍數=47.94/26.47=1.81。

2.3 類胡蘿卜素抗氧化試驗結果

圖5 洗脫劑對紅葉石楠類胡蘿卜素純化效果的影響

圖6 吸附劑對紅葉石楠類胡蘿卜素純化效果的影響

圖7 上柱量對紅葉石楠類胡蘿卜素純化效果的影響

紅葉石楠類胡蘿卜素提取液及抗壞血酸清除率對比見圖8。

圖8 紅葉石楠類胡蘿卜素提取液及抗壞血酸清除率對比

由圖8可知，當羥自由基清除率相同的情況下，所需要的紅葉石楠提取液質量濃度低于抗壞血酸濃度，如果提高提取液的質量濃度，清除率也會大大提高，由此可知紅葉石楠類胡蘿卜素抗氧化能力較強。

3 結論

從石楠葉提取類胡蘿卜素的最佳條件為提取溶劑為丙酮，提取時間60 min，提取溫度40℃，料液比1∶20（g∶mL），提取率達0.052 9%。在室溫下，以丙酮∶石油醚（7∶3） 為洗脫劑，硅膠∶硅藻土（1∶1） 為吸附劑，上樣量為1.5 mL，粗提物可以初步純化，純化倍數為1.81。

紅葉石楠類胡蘿卜素具有較好的羥基自由基清除能力，作為天然食品抗氧化劑有一定的開發應用前景。