商陸均一多糖對小鼠脾細胞增殖及細胞因子分泌的影響

李曉亮，魏娜，王鵬程，匡海學，王秋紅

(1.海南醫學院，海南 海口 571199；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006)

商陸radix phytolaccae又名夜呼(《本經》)、野蘿卜、為商陸科植物商陸phytolaccaacinosaroxb.或垂序商陸PhylolaccaamericanaL.的根，多生于樹林下、林緣、路旁、山溝等濕潤地方，我國大部分地區都有分布[1]。作為傳統中藥，商陸具有逐水消腫、通利二便、解毒散結的功效；主治水腫脹滿、二便不通，外治癰腫瘡毒等[2]。商陸中含有多種化學成分，主要為三萜皂苷類、多糖類、酚酸類、甾醇類、黃酮類、鞣質類、揮發油類以及脂溶性成分等[3]。現代藥理學研究發現商陸中所含多糖是其增強免疫、抗腫瘤和保護造血功能的活性成分。課題組前期對商陸多糖進行了深入的研究，將商陸總多糖分離純化得到7種商陸均一多糖[4]。本文通過觀察商陸均一多糖對ConA誘導的T淋巴細胞和LPS誘導的B淋巴細胞增殖的影響，為闡明商陸多糖的免疫作用機制提供參考。

1 材料與試劑

1.1 實驗藥物

商陸總多糖以及7種商陸均一多糖PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4、PAP-5、PAP-6和PAP-7均由黑龍江中醫藥大學北藥基礎與應用研究教育部重點實驗室提供。

1.2 實驗動物

清潔級昆明小鼠，雄性，體質量(20±2)g，由黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心提供。

1.3 實驗試劑

RPMI-1640培養液(美國Hyclone公司);胎牛血清FBS(美國Hyclone公司);雙抗(含青霉素和鏈霉素各10000 U·mL-1)(吉諾生物醫藥技術有限公司);二甲基亞砜(DMSO)(美國sigma公司);噻唑藍(MTT)(美國sigma公司);刀豆蛋白(ConA)(美國sigma公司);脂多糖(LPS)(美國sigma公司);小鼠IL-2細胞因子檢測試劑盒(武漢博士德公司，中國);小鼠IL-4細胞因子檢測試劑盒(武漢博士德公司，中國);小鼠IL-6細胞因子檢測試劑盒(武漢博士德公司，中國);小鼠IFN-γ細胞因子檢測試劑盒(武漢博士德公司，中國)。

1.4 儀器與設備

MS204S分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司);CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司);SW-CJ-2D潔凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備有限公司);MCO-18M二氧化碳培養箱(日本三洋有限公司);Synergy Mx多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司);TDL-4臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

2 方法

2.1 試劑的配制

含10%胎牛血清的RPMI1640培養基(完全培養液)：量取89 mL RPMI1640培養基，加入10 mL胎牛血清，再加入1 mL雙抗，混合均勻，0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃冰箱中保存。

ConA溶液：精密稱量ConA 3.5 mg溶于10 mL RPMI1640培養液(不含血清)中，濃度為0.35 mg/mL，0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃冰箱中保存。實驗時，10倍稀釋為所用濃度。

LPS溶液：精密稱量7 mg LPS溶于10 mL不完全RPMI1640培養液(不含血清)中，濃度為0.7 mg/mL，0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃冰箱中保存。實驗時，10倍稀釋為所用濃度。

2.2 小鼠脾淋巴細胞的制備

參照文獻方法[5-6]，取雄性昆明種小鼠，頸椎脫臼法處死，于超凈臺中無菌取脾臟。將脾臟置于盛有RPMI1640培養基的平皿中剪碎，破碎的脾臟置于200目金屬篩網上，用注射器芯研磨透過篩網，完全培養基沖洗，制成脾細胞懸液。1 000 r·min-1離心10 min，加入紅細胞裂解液靜置3 min，1 000 r·min-1離心10 min以除去血紅細胞。RPMI1640培養基洗3次，每次1 000 r·min-1離心10 min，離心棄上清。用RPMI1640完全培養基制成單細胞懸液，計數，調整細胞數為4.8×106個/mL，臺盼藍染液檢測細胞的存活率，活細胞比率大于95%即可用于實驗。

2.3 商陸多糖對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響

準確稱取各多糖樣品1～2 mg，溶于適量完全培養基中，濃度為4 mg/mL。使用前分別取適量上述多糖溶液稀釋至濃度為5 μg/mL、25 μg/mL和125 μg/mL。將多糖各個濃度100 μL/孔(陽性對照ConA為5 μg/mL，LPS為10 μg/mL)，均設6個復孔，100 μL/孔，加入96孔培養板中，以RPMI-1640對照。每孔加細胞懸液100 μL，置37℃、5% CO2培養48 h，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h，棄掉上清液，再加入二甲亞砜100 μL，于微量振蕩器上緩慢作用10 min，在酶標儀上于490 nm處測吸光度值。

2.4 商陸多糖對小鼠T、B淋巴細胞分泌細胞因子的影響

制備小鼠脾淋巴細胞懸液，調整細胞濃度為5×107個/mL，加入到96孔培養板中，設對照組、商陸總多糖組及均一多糖各組(PAP-X的終濃度為5、25、125 μg/mL)，每一質量濃度4個復孔，置于37℃、含5%的CO2條件下分別培養48 h，收集上清液測定細胞因子含量。

3 實驗結果

3.1 商陸多糖對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響

實驗結果見表1。由結果可知，商陸總多糖PAP在25 μg/mL、125 μg/mL的濃度下能夠顯著刺激脾淋巴細胞增殖(P<0.05)。七種商陸均一多糖中，PAP-2、PAP-4、PAP-5、PAP-6及PAP-7對小鼠脾淋巴細胞增殖產生顯著的增強作用，而PAP-1、PAP-3的不同濃度對小鼠脾淋巴細胞增殖影響不明顯(P>0.05)。

表1 商陸多糖對小鼠T、B淋巴細胞增殖活性的影響

注：與空白組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

3.2 商陸多糖對小鼠T、B淋巴細胞分泌的細胞因子的影響

實驗結果見表2。從結果可知，與空白組比較，商陸總多糖PAP在25 μg/mL、125 μg/mL的濃度下能夠顯著刺激脾細胞分泌IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ。七種商陸均一多糖中，PAP-2、PAP-4、PAP-5、PAP-6及PAP-7對小鼠脾細胞分泌細胞因子產生非常顯著的增強作用，而不同濃度的PAP-1、PAP-3對小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子影響不顯著(P>0.05)。

組別濃度(μg/mL)IL-2(pg/mL)IL-4(pg/mL)IL-6(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)空白組—46.33±6.16145.12±16.2592.24±9.9818.99±2.43PAP548.12±7.02147.05±17.3293.12±10.0219.24±3.052552.17±7.52*149.22±16.87102.45±10.14*23.11±3.21*12560.82±7.13**155.21±17.29*134.52±14.13**29.47±4.71**PAP-1545.71±5.42150.24±15.8189.85±8.1018.29±3.562548.23±4.27143.20±17.2795.31±9.0718.33±3.2912549.54±7.14151.03±19.2996.87±10.1119.28±4.41PAP-2545.42±4.05144.21±16.5194.58±9.3220.15±3.152548.51±5.57148.18±15.33105.31±10.07*22.09±2.78*12565.12±5.12**179.21±16.29**121.77±13.24**27.68±3.65**PAP-3546.26±6.20148.17±16.0890.27±8.2416.31±2.412547.03±6.35145.33±19.3692.38±9.3518.57±2.8512549.18±7.25150.23±20.3095.97±11.2519.47±3.54PAP-4547.02±4.24143.89±17.3493.36±9.5718.15±2.042550.25±5.05*146.34±16.67105.31±10.44*19.17±2.5712565.41±6.33**183.21±17.55**117.74±11.54**23.24±3.04*PAP-5548.28±5.57142.47±16.2790.36±9.6818.77±2.562549.32±6.31147.57±15.7899.47±10.55*18.17±2.1412551.14±5.73*194.07±19.45**117.74±11.54**22.14±3.14*PAP-6551.48±5.31*144.27±15.3599.78±9.98*19.07±2.962558.37±6.09**148.10±16.27106.37±11.64**22.17±2.56*12553.14±6.73*152.07±14.45*129.54±12.37**31.47±3.77**PAP-7547.42±5.21147.24±16.0694.78±10.9819.75±2.362550.35±6.21*145.57±15.3795.37±10.5820.09±2.7512564.03±7.52**151.88±15.35*116.37±12.57**25.47±3.57*

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

脾臟是機體最大的免疫器官，是免疫應答和免疫調節的重要器官，是T淋巴細胞和B淋巴細胞的定居場所[7-8]。T淋巴細胞和B淋巴細胞是構成機體免疫器官及系統的基本單位，在免疫應答過程中起核心作用，其增殖是反映細胞免疫最直接的指標[9]。活化的免疫細胞和非免疫細胞經刺激合成、分泌具有多種生物活性的細胞因子，如IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ等是機體免疫調節中重要的調節因子。其中IL-2和IFN-γ主要介導細胞免疫反應，在誘發器官特異性自身免疫、器官移植排斥反應和抗感染免疫中起著重要的免疫調節作用[10]。IL-2是由活化的T細胞產生的一種免疫調節因子，能夠促進T淋巴細胞的增殖與分化，具有廣譜的免疫增強活性[11]。IL-4又稱B細胞生長因子，可增強IgG和IgE水平，也可促進T細胞增殖。IL-6可誘導B細胞分化，還能與IL-1協同促進T細胞增殖[12]。IFN-γ可增強NK細胞和巨噬細胞溶酶體的活力，從而起到免疫調節作用[13-14]。本研究采用小鼠脾細胞進行體外培養，觀察商陸均一多糖對小鼠脾細胞增殖的作用。實驗結果表明，商陸總多糖以及均一多糖中的PAP-2、PAP-4、PAP-5、PAP-6和PAP-7對小鼠T、B淋巴細胞增殖具有顯著的促進作用，并且能夠促進細胞因子IL-2，IL-4，IL-6和IFN-γ的分泌。通過本研究，進一步深化了對商陸多糖的免疫調節藥效物質基礎和功效的認識，為合理開發商陸藥材提供理論依據。